麻城黑山羊微衛(wèi)星標記多態(tài)性分析

摘要：為了解麻城黑山羊群體的遺傳多樣性，選擇了位于不同染色體上、具有較高多態(tài)性的10個微衛(wèi)星標記，對麻城黑山羊群體進行研究。結(jié)果表明，BM1329等10個微衛(wèi)星標記共檢測到171個等位基因，每個標記都檢測到9個以上（平均為17.1個）的等位基因，有效等位基因數(shù)為7.1～18.1個，基因頻率最高的是OarAE101標記的100 bp片段（0.239 1）；10個微衛(wèi)星標記多態(tài)信息含量（PIC）都在0.95以上，均為高度多態(tài)標記，遺傳多樣性豐富，其中BMS1591標記的多態(tài)信息含量（PIC）最高，為0.996 9，各標記的平均雜合度在0.707 4～0.976 5之間，遺傳雜合度在0.859 0～0.944 6之間，平均遺傳雜合度為0.906 7，屬于高度雜合標記和高度雜合品種，遺傳變異大。

關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星標記；遺傳多態(tài)性；麻城黑山羊

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4454-04

麻城黑山羊產(chǎn)于大別山及其周邊的廣大地區(qū)，主產(chǎn)區(qū)在湖北麻城市，是優(yōu)良的黑色地方品種資源。對于麻城黑山羊的相關(guān)研究，過去多限于體型外貌、體尺測量、生產(chǎn)性能測定等方面，很少在分子水平上開展研究，品種的選育尚停留在常規(guī)育種領(lǐng)域，嚴重阻礙了該品種的選育提高和進一步發(fā)展。

微衛(wèi)星（Microsatellite）是廣泛分布于生物基因組中的簡單重復序列，20世紀80年代，Miesfeld等[1]在人類基因組的研究中首先發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星DNA，它一般由2～6個堿基組成核心單元，重復幾次至幾十次不等，數(shù)量龐大且分布均勻，在染色體上平均每10kb就出現(xiàn)一個，同時具備保守性、等顯性遺傳、多態(tài)性豐富、易被檢測、進化所受選擇壓力小等特點，在物種遺傳圖譜構(gòu)建、品種遺傳多樣性分析、種間遺傳距離估測、親子鑒定、數(shù)量性狀基因座（QTL）的檢測與定位、雜交優(yōu)勢預(yù)測等方面具有很大的應(yīng)用價值，也使之成為繼RFLP之后的第二代分子標記技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于羊的遺傳育種領(lǐng)域，為羊育種開辟了一條新的途徑。

遺傳多樣性（Genetic diversity）是生物多樣性的基礎(chǔ)和核心。最初采用血液蛋白多態(tài)性、酶多態(tài)性等來研究群體的遺傳多樣性，但結(jié)果的可信度不高。隨著育種技術(shù)的發(fā)展，從分子水平上為群體遺傳多態(tài)性的研究提供了更好的途徑，如微衛(wèi)星標記既可反映個體的遺傳相似程度，又能反映群體之間的遺傳相似程度，在遺傳多樣性評估、畜禽品種資源的分類、保護和利用等方面具有重要價值。國內(nèi)外利用微衛(wèi)星標記對羊品種的遺傳多態(tài)性研究非常普遍。Luikart等[2]用22個微衛(wèi)星標記檢測山羊家系，22個標記的平均雜合度為0.611 0，等位基因數(shù)2～11，其中安哥拉山羊平均雜合度為最高。Kim[3]用9個微衛(wèi)星標記分析朝鮮和中國山羊，共檢出62個等位基因，每個標記都具多態(tài)性，等位基因數(shù)4～10。Chenyambuga[4]用19個微衛(wèi)星標記分析非洲山羊品種遺傳多樣性，結(jié)果每個標記均表現(xiàn)多態(tài)性，等位基因數(shù)均大于4。蘭蓉等[5]用11個微衛(wèi)星標記分析了云南肉山羊黑色品系，得到了品系內(nèi)不同家系的遺傳多態(tài)性信息和公羊間的親緣關(guān)系。湯存?zhèn)サ萚6]研究了10個微衛(wèi)星標記在新疆13個綿羊群體中的遺傳多態(tài)性，計算得到的群體平均多態(tài)信息含量為0.680 3，平均雜合度為0.719 2。郎俠等[7]用15個微衛(wèi)星標記分析蘭州大尾羊，共檢測到153個等位基因，群體多態(tài)信息含量0.776 2。郭丹等[8]用微衛(wèi)星標記研究了遼寧絨山羊的遺傳多樣性，7個標記均呈高度多態(tài)性，遺傳多樣性豐富。毛楊毅等[9]用微衛(wèi)星標記研究呂梁黑山羊等4個山西地方山羊品種，5個基因座共檢測到67個等位基因，多態(tài)性豐富。

本研究選擇10個微衛(wèi)星標記，對麻城黑山羊群體進行檢測，統(tǒng)計分析標記的多態(tài)性、基因雜合度等，為了解麻城黑山羊的群體遺傳多樣性，進一步尋找與麻城黑山羊毛色、生長、繁殖等相關(guān)的遺傳標記提供理論依據(jù)，為麻城黑山羊新品系的培育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麻城黑山羊血樣，在湖北省麻城黑山羊種羊場采集。所用的試劑包括Tris、EDTA、SDS、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTPs等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，微衛(wèi)星引物10對（引物信息見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯pH計、高速臺式離心機、PCR擴增儀（普通、梯度）、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.3 血樣采集及DNA提取

采集麻城黑山羊靜脈血199頭份，置于低溫保溫箱帶回實驗室。提取DNA，溶解于TE。最終提取出可用的基因組DNA樣品為189頭份。

1.4 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系20 μL：10×Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0～2.4 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，8 pmol/μL兩側(cè)引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補充至20 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s，53.0～60.0 ℃退火30 s（因標記而異），72 ℃延伸40 s，共38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。各反應(yīng)體系引物的MgCl2用量、退火溫度見表2。以2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.5 統(tǒng)計分析

1.5.1 統(tǒng)計軟件 用Band Scan 5.0軟件獲得等位基因的大小，根據(jù)公式計算各微衛(wèi)星座位的等位基因頻率、 多態(tài)信息含量、 雜合度等。

1.5.2 多態(tài)信息含量 采用以下公式計算多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

由圖1可知，BM1329等10個微衛(wèi)星標記的PCR擴增產(chǎn)物的條帶均為一條或兩條，符合微衛(wèi)星標記的基本特征，可用于后續(xù)的遺傳信息分析。

2.2 微衛(wèi)星標記的等位基因分析

利用Band Scan 5.0軟件進行微衛(wèi)星標記的等位基因及基因頻率分析，經(jīng)統(tǒng)計得知，BM1329等10個微衛(wèi)星標記共檢測到171個等位基因，每個標記都檢測到9個以上的等位基因，說明所選擇的微衛(wèi)星標記遺傳信息比較豐富。在所有微衛(wèi)星標記中，以BMS1591標記檢測到的等位基因數(shù)目最多，為23個，其片段大小為187～273 bp；其次是BM143標記，為22個等位基因，其片段大小為78～170 bp；OarHH35標記的等位基因數(shù)目最少，只檢測到9個等位基因，片段大小為97～125 bp。

在所有檢測到的等位基因中，以O(shè)arAE101標記、100 bp片段的基因頻率最高，為0.239 1，其次是OarHH35標記、97 bp片段的基因頻率（0.234 0）；而BMS2508標記的135 bp片段、OarHH55標記的150 bp片段的基因頻率最低，均為0.002 7?？梢钥吹?，所有基因的基因頻率都不高（最高者僅0.239 1），這可能是群體基因分布較均勻等因素所造成。

每個微衛(wèi)星標記上觀察到的等位基因數(shù)及統(tǒng)計后的有效等位基因數(shù)如表3所示。有效等位基因數(shù)（Ne）反映了群體遺傳變異大小。有效等位基因數(shù)接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因分布均勻。根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，BM1329、BM3413、BMS2508和BM143等標記的等位基因觀察數(shù)和有效等位基因數(shù)都相差較大（絕對相差值在6.7～8.1），說明在這些基因座上，群體的等位基因分布不均勻，遺傳差異較大，這可能是由于地理隔離以及人工選擇所造成。

2.3 多態(tài)信息含量與雜合度

多態(tài)信息含量（PIC）用來描述微衛(wèi)星標記的變異程度，用于估計群體內(nèi)的遺傳變異程度。一般認為，當PIC>0.5時為高度多態(tài)標記，0.25

由表4可知，本研究中的10個微衛(wèi)星標記均為高度多態(tài)標記，多態(tài)信息含量都在0.95以上，說明基因變異較大，遺傳多樣性豐富，同時也說明本研究所選用的微衛(wèi)星標記均能提供較好的遺傳信息，可以反映麻城黑山羊群體的遺傳多樣性。其中BMS1591標記的多態(tài)信息含量最高，為0.996 9，其次是BM143標記，為0.995 7；OarAE101標記的多態(tài)信息含量最低，為0.980 1。10個微衛(wèi)星標記的平均雜合度（H）在0.707 4～0.976 5之間，群體遺傳雜合度（h）在0.859 0～0.944 6之間，品種的平均群體遺傳雜合度為0.906 7，均屬于高度雜合標記和高度雜合品種。較高的品種雜合度，表明品種的遺傳多樣性信息豐富；較高的微衛(wèi)星標記雜合度，說明該標記所能提供的遺傳信息量更大。同時，雜合度的高低，還在一定程度上反映了品種的選育過程，如所用的親本材料來源廣泛、或?qū)肓送庋?、選育時間短，均會提高雜合度。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

BM1329等10個微衛(wèi)星標記共檢測到171個等位基因，平均為17.1個，其中以BMS1591標記檢測到的等位基因數(shù)目最多（為23個），其次是BM143標記（22個），OarHH35標記的等位基因數(shù)目最少（9個）。基因頻率最高的是OarAE101標記的100 bp片段（0.239 1），其次是OarHH35標記的97 bp片段（0.234 0），而BMS2508標記的135 bp片段、OarHH55標記的150 bp片段的基因頻率最低，均為0.002 7。

10個微衛(wèi)星標記多態(tài)信息含量都在0.95以上，均為高度多態(tài)標記，其中BMS1591標記的多態(tài)信息含量最高，為0.996 9，其次是BM143標記，為0.995 7；OarAE101標記的多態(tài)信息含量最低，為0.980 1。平均雜合度在0.707 4～0.976 5之間，群體遺傳雜合度在0.859 0～0.944 6之間，平均群體遺傳雜合度為0.906 7，屬于高度雜合標記和高度雜合品種，遺傳變異大。

3.2 討論

3.2.1 微衛(wèi)星座位的選擇 大量的理論研究和實踐表明，研究群體的雜合度、群體間遺傳距離時，所用標記的數(shù)目對結(jié)果的精確性和可靠性非常重要，數(shù)目越多則結(jié)果的精確性越高，但工作量和費用相應(yīng)較高。在本研究中，選用了分布在不同染色體上（10個微衛(wèi)星標記分別分布在6條染色體上）、多態(tài)性較高的標記，以盡可能提供較多的遺傳信息，且擴增產(chǎn)物的片段大小多在80～270 bp之間，便于獲得擴增產(chǎn)物和結(jié)果統(tǒng)計。同時，這10個標記已有對羊的生長發(fā)育、繁殖等性狀具有正效應(yīng)的研究結(jié)果，便于下一步開展此方面的研究。本研究結(jié)果表明，10個微衛(wèi)星標記均檢測到9個及以上（平均17.1個）的等位基因，多態(tài)信息含量非常豐富，客觀地反映了麻城黑山羊的遺傳信息。

3.2.2 電泳 微衛(wèi)星的PCR擴增產(chǎn)物多采用聚丙烯酰胺凝膠作為載體，在垂直槽上進行電泳，它的分析結(jié)果在精確度上高于瓊脂糖法，但凝膠的制備非常麻煩，電泳過程耗時很長，成本也較高。近年來也有采用毛細管電泳的[5]，它是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物，采用毛細管電泳原理制作的全自動分析儀，具有自動上樣、高通量、檢測靈敏度高、分辨率高、樣本消耗少、分析快速等優(yōu)點，并可進行全自動數(shù)據(jù)記錄和輸出膠圖、條帶長度和濃度。本研究采用的是較為傳統(tǒng)的瓊脂糖法，雖然其分辨效果不如前兩種方法，但制膠容易、電泳時間短、效率也較高、成本較低，只要掌握好凝膠濃度、電壓和電泳時間，避免出現(xiàn)條帶未分開、邊緣效應(yīng)等問題，同樣可取得較理想的分析結(jié)果。

3.2.3 關(guān)于群體遺傳多樣性 多態(tài)信息含量和群體遺傳雜合度都不同程度地反映出品種的遺傳多樣性。在本研究中，麻城黑山羊的平均PIC在0.980 1～0.996 9之間，平均遺傳雜合度在0.859 0～0.944 6之間，說明其遺傳基礎(chǔ)廣泛、遺傳多樣性豐富。而平均雜合度低于平均遺傳雜合度，表明品種中用于配種的種公羊數(shù)量較少，存在一定程度的近交，也可能是長期對某一性狀的選擇，造成整體血統(tǒng)狹隘，或是品種曾經(jīng)歷過始祖效應(yīng)，這些都會造成基因純合較多。

參考文獻：

[1] MIESFELD R， ARNHEIM. Species-specific rDNA transcription is due to promoter-specific binding factors [J]. Molecular and Cellular Biology，1984，4（2）：221-227.

[2] LUIKART G， BIJUDUVAL M P， ERTUGRUL O， et al. Power of 22 microsatellite markers in fluorescent multiplexes for parentage testing in goats[J]. Animal Genetics，1999，30（6）： 431-438.

[3] KIM K S. Genetic diversity of goats from Korea and China using microsatellite analysis Asian-Australasian[J]. Journal of Animal Sciences，2002，15（4）：461-465.

[4] CHENYAMBUGA S W. Genetic characterization of indigenous goats of Sub-saharan Africa using microsatellite DNA markers Asian-Australasian[J]. Journal of Animal Sciences，2004，17（4）：445-452.

[5] 蘭 蓉，朱 蘭，王 鵬，等.云南肉山羊黑色品系內(nèi)不同家系遺傳多樣性分析[J].中國草食動物，2012，32（2）：8-12.

[6] 湯存?zhèn)?，?雄，劉武軍，等.新疆13個綿羊群體遺傳多樣性及遺傳分化的研究[J].家畜生態(tài)學報，2011（1）：13-19.

[7] 郎 俠，呂瀟瀟.蘭州大尾羊微衛(wèi)星DNA多態(tài)性研究[J].中國畜牧雜志，2011（1）：14-17.

[8] 郭 丹，韓 迪，王春艷，等.遼寧絨山羊7個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：99-103.

[9] 毛楊毅，羅惠娣，郭慧慧，等.山西4個地方山羊品種的遺傳多樣性分析[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2010，45（5）：15-20.