何首烏不同溶劑提取液的體外抑菌活性研究

摘要：采用60%丙酮、70%乙醇、沸水3種溶劑制備何首烏（Polygonum multiflorum Thumb）塊根粉末提取液，以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏菌（Klebsiella peneumoniae）、大腸桿菌（Escherichia coli）為供試菌株，通過濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測定提取液的抑菌圈大小，以平板二倍稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC），以試管二倍稀釋法測定最低殺菌濃度（MBC）。結(jié)果表明，何首烏3種溶劑提取液對(duì)供試菌株均有明顯的抑制作用，其中60%丙酮提取液和70%乙醇提取液抑菌效果優(yōu)于沸水提取液，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，丙酮提取液和乙醇提取液的抑菌、殺菌效果隨濃度的降低而下降。

關(guān)鍵詞：何首烏；抑菌活性；體外測定

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）18-4390-04

何首烏（Polygonum multiflorum Thumb）為蓼科蓼屬植物，其塊莖為滋補(bǔ)良藥[1]，中醫(yī)用于治療肝腎精血虧虛、頭昏目眩、須發(fā)早白、腰酸遺精、膽固醇過高等[2]。

植物中的萜類、酚類、生物堿類、黃酮類、苷類和醌類等化合物具有殺菌作用[3]。何首烏中含有蒽醌類化合物、二苯乙烯苷類化合物和磷脂類化合物等活性成分，其中二苯乙烯苷可能是主要的活性成分[4]。研究表明何首烏能提高或改善小鼠的記憶能力，減輕鈣超載引起的腦損傷，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[5，6]；能明顯提高小鼠的記憶力，提高腦內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性[7]；何首烏70%乙醇提取液可有效對(duì)抗D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老，具有抗衰老作用[8]。試驗(yàn)探討了何首烏3種不同溶劑提取液對(duì)4種常見致病菌的抑菌活性，以期為何首烏的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 何首烏塊根，購于臨海市臨江大藥房，經(jīng)70 ℃烘干后研磨成粉末，貯存于干燥皿中。

1.1.2 供試菌株與培養(yǎng)基 供試菌株為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸桿菌（Escherichia coli），均由浙江省臺(tái)州醫(yī)院惠贈(zèng)，為臨床分離菌株。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[9]配制，121 ℃高壓滅菌20 min備用。

1.1.3 主要儀器 HVE-50型高壓滅菌鍋（日本Hirayama Manufacturing公司）；YJ型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州潔凈技術(shù)研究所）；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司），QYC-2102C型全溫培養(yǎng)搖床（寧波江南儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 何首烏提取液制備 稱取何首烏粉末100 g，分別用60%丙酮、70%乙醇和沸水3種溶劑浸提，反復(fù)多次，直至浸出液顏色變淡為止。將浸出液合并濃縮至80 mL，用NaOH調(diào)pH至7.0，定容至100 mL，制成濃度為1 000 mg/mL的何首烏提取液，提取液過0.22 μm濾膜除菌，貯存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 菌液的制備 菌種接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃活化24 h后取50 μL接入5 mL牛肉膏液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)6 h后，取出稀釋104、105、106倍，涂牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落。

1.2.3 抑菌圈的測定 用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測定何首烏不同溶劑提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和肺炎克氏菌的抑菌活性。將直徑為6 mm的無菌濾紙片分別置于何首烏乙醇提取液、丙酮提取液和沸水提取液中浸泡20 min。將菌液稀釋至106 CFU/mL，取100 μL涂平板，于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)15～20 min，待培養(yǎng)基表面干燥后，分別貼上已浸泡過的濾紙片，每處理4個(gè)重復(fù)，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。以涂布100 U/mL硫酸鏈霉素溶液為的陽性對(duì)照，以涂布無菌水的為陰性對(duì)照。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 用平板二倍稀釋法測定丙酮提取液和乙醇提取液對(duì)4種供試菌的抑菌效果。分別配制提取液終濃度為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨平皿固體培養(yǎng)基，每組4個(gè)重復(fù)。平皿中涂布活化后的菌液（104 CFU/mL）20 μL， 30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，與對(duì)照（無菌水）相比計(jì)算抑菌率。以沒有供試菌生長的最小濃度為提取液的MIC。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測定 用試管二倍稀釋法測定丙酮提取液和乙醇提取液對(duì)4種供試菌的殺菌效果。配制提取液終濃度為500.0、250.0、125.0、62.5 mg/mL的試管液體培養(yǎng)基，每組4個(gè)重復(fù)。每支試管中加入菌液（105 CFU/mL）100 μL，30 ℃振蕩培養(yǎng)3、6、12 h后，分別取培養(yǎng)液20 μL，涂布于牛肉膏固體平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，與對(duì)照（無菌水）相比計(jì)算殺菌率和最低殺菌濃度（MBC）。以平板上菌落少于5個(gè)的最小濃度為提取液的MBC。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 13.0軟件輔助處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 何首烏不同提取液的抑菌效果

濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測定結(jié)果（表1）顯示，何首烏3種溶劑提取液對(duì)4種供試菌株均有明顯的抑制作用，丙酮提取液和乙醇提取液抑菌效果優(yōu)于沸水提取液。對(duì)于金黃色葡萄球菌和肺炎克氏菌，丙酮提取液和乙醇提取液的抑菌圈均顯著大于沸水提取液；對(duì)于大腸桿菌，丙酮提取液的抑菌圈最大，顯著大于沸水提取液；對(duì)于綠膿桿菌，乙醇提取液的抑菌圈最大，顯著大于沸水提取液。

2.2 何首烏不同提取液的最低抑菌濃度

2.2.1 丙酮提取液的最低抑菌濃度 何首烏丙酮提取液最低抑菌濃度的測定結(jié)果（表2）顯示，何首烏丙酮提取液對(duì)4種供試菌株的抑菌效果不盡相同。最低抑菌濃度，金黃色葡萄球菌為50.0 mg/mL，大腸桿菌為100.0 mg/mL，綠膿桿菌和肺炎克氏菌均為200.0 mg/mL；在未達(dá)到完全抑制的濃度下，抑菌效果隨著提取液作用濃度的降低而顯著降低。在提取液濃度為50.0 mg/mL時(shí)，抑菌效果從高到低依次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克氏菌、綠膿桿菌，100.0 mg/mL提取液也表現(xiàn)出相近情況。

2.2.2 乙醇提取液的最低抑菌濃度 乙醇提取液的最低抑菌濃度測定結(jié)果（表3）顯示，何首烏乙醇提取液對(duì)4種供試菌株的抑菌效果不同。對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為100.0 mg/mL，對(duì)其他3種均為200.0 mg/mL；在未達(dá)到完全抑制時(shí)，抑菌效果隨著提取液作用濃度的降低而顯著降低。在提取液濃度為25.0 mg/mL時(shí)，抑菌效果從高到低依次為金黃色葡萄球菌、肺炎克氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌，100.0、50.0 mg/mL提取液也表現(xiàn)出類似情況。

2.3 何首烏提取液的最低殺菌濃度

何首烏丙酮提取液的最低殺菌濃度測定結(jié)果（表4）顯示，丙酮提取液對(duì)4種供試菌均有一定的殺菌效果。在提取液濃度為500.0 mg/mL時(shí)，殺菌率均超過96%；而濃度低于500.0 mg/mL時(shí)，只有對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率能達(dá)到95%，且隨著作用濃度的降低，殺菌效果顯著下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，作用濃度為500.0 mg/mL時(shí)的殺菌率總體上略為提高，其他濃度則明顯下降，其中3 h與12 h的差異達(dá)到顯著水平，說明丙酮提取液的殺菌效果不僅決定于濃度，還與培養(yǎng)時(shí)間有一定的關(guān)系。

何首烏乙醇提取液的最低殺菌濃度測定結(jié)果（表5）顯示，乙醇提取液對(duì)4種供試菌株均有一定的殺菌效果。在提取液濃度為500.0 mg/mL時(shí)，殺菌率均超過96%；在低于500.0 mg/mL時(shí)，殺菌率均未達(dá)到95%，且隨著作用濃度的降低，殺菌效果顯著下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，濃度為500.0 mg/mL時(shí)總體上殺菌率略為提高，其他濃度則明顯下降，其中3 h與12 h的差異達(dá)到顯著水平，說明乙醇提取液的殺菌效果不僅決定于濃度，還與培養(yǎng)時(shí)間有一定的關(guān)系。

3 小結(jié)與討論

何首烏具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂以及提高免疫系統(tǒng)功能等多種作用，臨床上主要用于治療高血脂[10，11]。何首烏水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、傷寒桿菌等均有不同程度的抑制作用，其有效作用成分可能是蒽醌類化合物及其衍生物[12]。本研究采用丙酮、乙醇和沸水3種溶劑對(duì)何首烏塊根進(jìn)行提取，結(jié)果表明，3種溶劑提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和肺炎克氏菌均有明顯的抑制作用，且丙酮提取液和乙醇提取液作用效果優(yōu)于沸水提取液。說明何首烏塊根中主要抑菌成分可能是脂溶性的，如醌類化合物及其衍生物；但沸水提取液也有一定的抑菌作用，說明何首烏的抑菌物質(zhì)還包含一些水溶性成分。何首烏中主要活性成分二苯乙烯苷具有良好的水溶性，沸水提取液表現(xiàn)出的抑菌活性可能與二苯乙烯苷類有一定的關(guān)系，具體情況有待進(jìn)一步研究。丙酮提取液和乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌濃度分別為50.0和100.0 mg/mL。但最低殺菌濃度檢測顯示，在作用濃度低于500.0 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)液中的活菌數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈現(xiàn)增加趨勢，說明兩種提取液的主要作用是抑菌。丙酮提取液和乙醇提取液殺菌效果不僅取決于濃度，且與作用時(shí)間、菌株有一定的關(guān)系，提示臨床用藥要綜合考慮藥物的作用時(shí)間、濃度和所針對(duì)的菌株。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張 芹.何首烏的滋補(bǔ)功效[J].養(yǎng)生保健中成藥，2006（4）：45.

[2] 莊玉林.何首烏補(bǔ)腎益血[J].醫(yī)藥與保健，1997（10）：45.

[3] 吳傳萬，杜小鳳，王偉中.植物源抑菌活性成分研究進(jìn)展[J].淮陰工學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，13（3）：28-33.

[4] 李建北，林 茂.何首烏化學(xué)成分的研究[J].中草藥，1993， 24（3）：115-118.

[5] 楚 晉，葉翠飛，李 林，等.二苯乙烯苷對(duì)D-半乳糖致腦老化小鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響[J].中國藥房，2005，16（1）：13-16.

[6] 劉治軍，李 林，葉翠飛，等.二苯乙烯苷對(duì)腦缺血嚙齒動(dòng)物腦NMDA受體及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2003， 19（10）：1112-1115.

[7] 楊小燕.制何首烏多糖對(duì)癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)酶活性的影響[J].藥學(xué)進(jìn)展， 2005，29（12）：557-559.

[8] 宋士軍，李芳芳，岳 華.何首烏的抗衰老作用研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（2）：90-91.

[9] 沈 萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 第三版. 北京：高等教育出版社，1999.

[10] RYU G， JU J H， PARK Y J， et al. The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum[J]. Arch Pharm Res， 2002，25（5）：636-639.

[11] 方 微，秦彥文，王綠婭.何首烏總苷調(diào)血脂抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2005（1）：48-51.

[12] 蘇煥群，陳再智.何首烏藥理研究進(jìn)展[J].中藥材，1993，16（2）：34-35.