貴州產(chǎn)堅龍膽組織培養(yǎng)體系的建立

摘要：以貴州野生堅龍膽（Gentiana rigescens Franch）帶有頂芽或腋芽的莖段作為外植體，建立堅龍膽的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L IBA。在組織培養(yǎng)過程中還觀察到了瓶苗開花的現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：堅龍膽（Gentiana rigescens Franch）；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基

中圖分類號：S567.23+9；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4250-03

Establishment of Tissue Culture System of Gentiana rigescens from Guizhou Province

ZHANG Jie，LIU Hong-mei

（Department of Medical Biotechnology， Guiyang Medical College， Guiyang 550004， China）

Abstract： Using stem segments with apical bud or auxiliary bud as explants， tissue culture system of Gentiana rigescens Franch from Guizhou province was established. The results showed that the optimal bud induction medium was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA； the optimal proliferation medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA； the appropriate rooting medium was 1/2MS+0.1 mg/L IBA. Furthermore， in vitro flowering phenomenon was observed during tissue culture of G. rigescens Franch.

Key words： Gentiana rigescens Franch； tissue culture； culture medium

收稿日期：2012-09-12

基金項目：貴陽醫(yī)學(xué)院院基金項目（2007-49）

作者簡介：張 潔（1978-），女，貴州都勻人，講師，碩士，主要從事藥用植物的組織培養(yǎng)研究，（電話）13595019732（電子信箱）annie@gmc.edu.cn。

堅龍膽（Gentiana rigescens Franch）為龍膽科龍膽屬植物，以其根莖入藥，是《中國藥典》收載的傳統(tǒng)中藥材龍膽（Radix Gentianae）的主要品種之一[1]，具有清肝膽實火、除下焦?jié)駸?、健脾、降壓和保肝利膽等多種功效[2]。貴州省為堅龍膽藥材道地產(chǎn)區(qū)之一，多年來的大量采挖造成堅龍膽野生資源瀕臨滅絕。堅龍膽的人工種植主要采用種子繁殖和分株繁殖兩種方式，但堅龍膽的種子小，育苗時間長，且種子繁殖存在品種退化的情況[3]，而分株繁殖的繁殖系數(shù)低，根莖用量大，限制了種植規(guī)模。組織培養(yǎng)是堅龍膽快速繁殖和推廣種植的有效途徑。目前龍膽屬植物組織培養(yǎng)的研究多數(shù)以北方產(chǎn)地的龍膽品種為主[4-9]，而主產(chǎn)于南方的堅龍膽僅見朱宏濤等[10]對云南產(chǎn)地的堅龍膽進行了組培快繁的研究。本研究對貴州產(chǎn)地的野生堅龍膽進行離體培養(yǎng)，建立系統(tǒng)的快速繁殖體系，以推動貴州省堅龍膽的規(guī)模化種植和中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化的進程。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生堅龍膽采集于貴陽市白云區(qū)牛場鄉(xiāng)，實驗選用其帶頂芽或腋芽的幼嫩莖段作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒與接種 采集的帶頂芽或腋芽的幼嫩莖段，經(jīng)常規(guī)清洗后在超凈臺上進行滅菌處理。先用體積分數(shù)75%的乙醇浸泡30 s，然后用30 mg/mL的次氯酸鈉溶液浸泡6 min，無菌水沖洗3～5次后再用30 mg/mL的次氯酸鈉溶液消毒6 min，無菌水沖洗7～8次后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖、7.5 g/L瓊脂粉，pH 5.9，并在121 ℃下滅菌20 min，添加不同濃度的6-BA和NAA（①MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；②MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間13 h/d，光照度

1 500 lx。

1.2.2 堅龍膽不定芽的增殖培養(yǎng) 把長勢較好的不定芽轉(zhuǎn)接到附加不同濃度的6-BA和NAA激素組合的MS培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與不定芽誘導(dǎo)條件相同，培養(yǎng)30 d后對不定芽的增殖與生長情況進行觀察統(tǒng)計。

1.2.3 試管苗的生根、移栽 將增殖壯苗培養(yǎng)后高1.5～2.0 cm的無根小苗切段，轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)基以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA和IBA，觀察生根情況，40 d后統(tǒng)計生根率、平均生根條數(shù)等。組培苗根系生成并長到合適長度后進行煉苗移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的滅菌和不定芽的誘導(dǎo)

由于外植體是在野外采集的，表面往往帶有較多的細菌和真菌，實驗表明，采用30 mg/mL的次氯酸鈉溶液滅菌兩次，既能達到較好的滅菌效果，又能減少對幼嫩組織的損傷。誘導(dǎo)培養(yǎng)中，采用帶頂芽或側(cè)芽的幼嫩莖段作為外植體，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA及MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA兩種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出不定芽，其中MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA只需15 d左右即能誘導(dǎo)出不定芽，且不定芽生長快、長勢好。

2.2 NAA與6-BA不同濃度組合對不定芽增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，NAA與6-BA不同濃度組合對不定芽增殖及生長的影響見表1。從表1可以看出，隨著6-BA濃度的升高，不定芽的增殖系數(shù)不斷提高，側(cè)枝和芽的分化增多，6-BA濃度升高到2.0 mg/L時繁殖系數(shù)最高，但芽苗的生長狀態(tài)差，細弱、矮小、生長緩慢，嚴重影響存活率。所以綜合考慮，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，增殖系數(shù)較高且芽苗生長快、外觀正常。

2.3 堅龍膽不定芽的生根及移栽

不同培養(yǎng)基中堅龍膽不定芽的生根情況見表2。從表2可以看出，各培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)不定芽生根，但在生根的時間和數(shù)量以及長勢上存在差別。較低濃度的IBA或NAA對芽苗的生根有一定的促進作用，但IBA或NAA濃度偏高，為1.0 mg/L時，芽苗莖段基部膨大并出現(xiàn)較多的愈傷組織，芽苗矮小，生長狀態(tài)不佳，出現(xiàn)氣生根，生根率反而下降。由此可見低濃度的生長素有利于芽苗生根，高濃度的生長素促進愈傷組織的分化，反而抑制了根的發(fā)生和生長。與相同濃度的NAA相比，IBA促進芽苗生根及生長的效果均優(yōu)于NAA。從基本培養(yǎng)基來看，與MS培養(yǎng)基相比，1/2MS培養(yǎng)基中芽苗的生根時間更短、生根率更高。但MS培養(yǎng)基中芽苗株型比1/2MS培養(yǎng)基中的稍大，尤其是葉片大且肥厚。各處理中1/2MS+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基生根所需時間最短，17 d左右即可生根，并且生根條數(shù)多，達6.2條/株，根系生長健壯，芽苗長勢良好，利于提高后期的移栽成活率。

2.4 煉苗移栽

當組培苗根系生成后，根長達到2 cm以上時在室溫下打開瓶口，煉苗2～3 d，以使小苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，從培養(yǎng)瓶中取出小苗，洗去苗根部瓊脂，移栽于高溫滅菌的等體積混合的蛭石-珍珠巖基質(zhì)中，注意保持溫濕度，移栽存活率可達85%以上。

3 小結(jié)與討論

堅龍膽作為貴州省的特產(chǎn)藥用植物，在自然資源不能滿足市場需求的情況下，積極探索新的繁殖方法是非常必要的。本研究對貴州產(chǎn)野生堅龍膽進行了離體培養(yǎng)，建立了其無性繁殖體系，確定適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L IBA。這與朱宏濤等[10]對云南產(chǎn)堅龍膽的研究結(jié)果不完全一致，其主要采用6-BA、KT和NAA/IAA 3種激素組合，在增殖培養(yǎng)階段還添加了水解酪蛋白。在試驗初期，本研究也采用了KT與6-BA和NAA配合使用，但效果不佳，而后只采用兩種常用的激素6-BA和NAA，反而取得了理想的不定芽誘導(dǎo)和增殖壯苗的效果，這可能是不同產(chǎn)地的外植體在生理特點和內(nèi)源激素水平上有差別導(dǎo)致的。

堅龍膽除了具有重要的藥用價值外，還具有較高的觀賞價值，由于分布在較高海拔的向陽區(qū)域，其具有獨特的花色、花型，是野生花卉中較為珍貴的類型[11，12]。本研究在試驗過程中發(fā)現(xiàn)堅龍膽在生根培養(yǎng)階段出現(xiàn)了瓶中開花的現(xiàn)象（圖1、圖2），為紫藍色小花，花多為多數(shù)，簇生枝頂，筒狀花冠，顏色和花型與野外的品種沒有明顯差別，只是花朵較野生植株小，花期持續(xù)約1個月。瓶中開花現(xiàn)象僅出現(xiàn)在以1/2MS為基本培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基中，在以MS為基本培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基中，芽苗雖然長勢好、健壯、莖粗壯、葉大而肥厚，但始終都沒有出現(xiàn)過開花現(xiàn)象，這說明堅龍膽開花可能需要較低的無機鹽水平，無機鹽濃度過高，芽苗營養(yǎng)生長過于旺盛，不利于生殖生長。在日本龍膽[13]及天藍龍膽[14]的瓶中開花的報道中，均采用了偏酸性（pH 4.5）的培養(yǎng)基來誘導(dǎo)開花，而本實驗中采用較低的無機鹽配合一定濃度的生長素，在pH 5.9的培養(yǎng)基中就能誘導(dǎo)堅龍膽瓶中開花。然而，花芽分化作為植物組織培養(yǎng)中的一種分化模式，是一個復(fù)雜的生理現(xiàn)象，受到諸多因素的影響，包括外源激素、營養(yǎng)條件、光周期、溫度等，這都需要更加深入系統(tǒng)的研究。

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（責任編輯 向 闈）