大孔吸附樹(shù)脂分離純化冬凌草甲素條件的優(yōu)化

摘要：比較了大孔吸附樹(shù)脂D-101、DM-130、AB-8和NKA-9對(duì)冬凌草甲素的吸附和解吸附能力。結(jié)果表明，AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素具有較好的吸附分離性能。其最佳分離純化工藝條件為，吸附時(shí)進(jìn)料濃度0.486 mg/mL、流速2 BV/h、進(jìn)樣量4 BV；解吸附時(shí)體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液作洗脫劑、流速1.5 BV/h、洗脫劑用量3 BV。經(jīng)AB-8樹(shù)脂吸附與解吸附后，冬凌草甲素回收率為78.4%；用甲醇重結(jié)晶后純度達(dá)到99.5%，回收率為54.3%。

關(guān)鍵詞：大孔吸附樹(shù)脂；冬凌草甲素；分離純化；吸附；解吸附

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）17-4201-04

Optimization of Separation and Purification Conditions of Rubescensine A by Macroporous Adsorption Resin

YE Hong-yong，ZUO Guang-ling，LI Ru-lin

（Department of Biological and Chemical Engineering， Nanyang Institute of Technology， Nanyang 473004， Henan，China）

Abstract： The adsorption and desorption capacities of four kinds of macroporous adsorption resins， D-101， DM-130， AB-8 and NKA-9 were compared. The results showed that AB-8 resin had the best adsorption and desorption capability. And the optimum technology parameters for adsorption were feeding concentration 0.486 mg/mL， flow rate 2 BV/h and feeding volume 4 BV； for desorption were 80%（volume fraction） alcohol as elution solvent， flow rate 1.5 BV/h and elution volume 3 BV. After treated with AB-8， the yield of rubescensine A was 78.4%. And the purity of rubescensine A could be up to 99.5% if recrystallized by methanol， and the yield was 54.3%.

Key words： macroporous adsorption resin； rubescensine A； separation and purification； adsorption； desorption

收稿日期：2012-09-13

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（122102210481）

作者簡(jiǎn)介：葉紅勇（1978-），男，河南南陽(yáng)人，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分的提取研究，（電話）0377-62076316（電子信箱）

yehongyong2009@163.com。

冬凌草（Isodon rubescens）又名碎米椏，為唇形科香茶屬多年生小灌木植物，廣泛分布于我國(guó)中部和南部，主產(chǎn)于河南太行山南麓濟(jì)源、焦作、鶴壁等地[1]。其主要成分二萜化合物冬凌草甲素（Rubescensine A）對(duì)腫瘤細(xì)胞有確切的殺傷、抑制增殖作用，主要用于治療食管癌、乳腺癌、直腸癌及賁門(mén)癌等腫瘤疾病[2]。目前，冬凌草甲素主要通過(guò)乙醇（或乙醚）回流提取、萃取、脫色、硅膠柱層析分離和結(jié)晶等工藝生產(chǎn)。然而由于冬凌草甲素為熱敏性成分，在回流提取時(shí)有效成分易發(fā)生變化[3，4]，而柱層析前的拌硅膠和裝柱工序操作勞動(dòng)強(qiáng)度大，工業(yè)化生產(chǎn)受到限制[5，6]。近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂被廣泛用于中草藥有效成分如黃酮[7]、多酚[8]、皂甙[9]等的分離富集以及中藥制劑的生產(chǎn)，而超聲波技術(shù)用于冬凌草甲素的提取可以避免高溫對(duì)冬凌草甲素有效成分的破壞[10]。本研究采用超聲波法提取冬凌草甲素，并進(jìn)一步利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行富集，探討了大孔吸附樹(shù)脂分離純化冬凌草甲素的最佳工藝條件和參數(shù)，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬凌草（HPLC法測(cè)定冬凌草甲素含量為0.623%）購(gòu)自河南省濟(jì)世藥業(yè)有限公司，冬凌草甲素對(duì)照品（純度>99.9%）由河南省生物研究所提供。D-101、DM-130、AB-8和NKA-9樹(shù)脂（天津市海光化工有限公司），玻璃層析柱（φ26 mm×600 mm，上海安瀾德生物科技有限公司），Prominence LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AL104型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）公司）。

1.2 冬凌草甲素提取液的制備

采用超聲波法提取冬凌草甲素，冬凌草干燥粉碎后過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱取100 g冬凌草粉末，每次加入800 mL 95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇，在500 W功率下超聲波提取3次，每次30 min，合并提取液，再加入30 g活性炭，超聲波脫色2次，每次15 min，濾液減壓濃縮至膏狀，用40%的乙醇在1 000 mL容量瓶中定容，HPLC法測(cè)得冬凌草甲素初始濃度C0為0.486 mg/mL。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜分析條件 Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取10 mg冬凌草甲素對(duì)照品置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液配制36、59、98、121、162、198 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。分別取10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=6 073.43X-3.36，r=0.999 8，表明冬凌草甲素在36～198 μg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

1.4 樹(shù)脂的預(yù)處理

樹(shù)脂先用95%的乙醇浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用95%的乙醇洗脫至流出液加5倍水不出現(xiàn)白色渾濁為止。去離子水洗盡乙醇，再用4倍樹(shù)脂體積的5%鹽酸浸泡2 h，去離子水洗至中性；再用50 mg/L氫氧化鈉浸泡2 h后用去離子水洗至中性，備用。

1.5 靜態(tài)吸附解吸附試驗(yàn)

分別精確稱取0.5 g 4種干樹(shù)脂置于150 mL具塞錐形瓶中，再分別加入50 mL冬凌草甲素樣品溶液。25 ℃、110 r/min恒溫振蕩至吸附平衡（約12 h），利用HPLC法測(cè)定并計(jì)算各樣品溶液中冬凌草甲素的平衡濃度；離心除去冬凌草甲素溶液后，加入50 mL 80%的乙醇溶液，25 ℃、110 r/min恒溫振蕩12 h，測(cè)定洗脫液中冬凌草甲素的濃度，按下列公式計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)：

Qe=■；

E=■×100%；

D=■×100%；

R=■×100%

式中，Qe為樹(shù)脂的平衡吸附量，mg/g；V1為冬凌草甲素樣品溶液體積，mL；C0為冬凌草甲素樣品溶液起始濃度，0.486 mg/mL；Ce為樣品溶液中冬凌草甲素的平衡濃度，mg/mL；m為干樹(shù)脂的質(zhì)量，g；E為樹(shù)脂的吸附率，%；D為樹(shù)脂的解吸率，%；V2為解吸時(shí)加入的乙醇溶液體積，mL；C1為洗脫液中冬凌草甲素的濃度，mg/mL；R為冬凌草甲素的回收率，11%。

1.6 動(dòng)態(tài)吸附和洗脫試驗(yàn)

室溫下，冬凌草甲素樣品溶液以一定的流速通過(guò)裝有預(yù)處理后的樹(shù)脂的層析柱，測(cè)定流出液中冬凌草甲素的濃度，考察吸附液流速和進(jìn)料濃度對(duì)樹(shù)脂吸附性能的影響，繪制泄漏曲線，確定樹(shù)脂的最佳吸附工藝條件。對(duì)已吸附冬凌草甲素的樹(shù)脂用乙醇溶液進(jìn)行解吸附試驗(yàn)，考察洗脫劑流速對(duì)樹(shù)脂解吸附性能的影響，并繪制解吸曲線，確定最佳洗脫液流速。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附解吸附特性

2.1.1 大孔吸附樹(shù)脂的選擇 冬凌草甲素屬于弱極性化合物，根據(jù)類似物吸附類似物的原則，樹(shù)脂的極性是影響其吸附性能的重要因素。為了篩選出適合用于冬凌草甲素吸附分離的樹(shù)脂，對(duì)D-101、DM-130、AB-8和NKA-9 4種不同極性樹(shù)脂的靜態(tài)吸附解吸附性能進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，隨著樹(shù)脂極性的增強(qiáng)，4種樹(shù)脂的吸附率逐漸升高，而解吸率則逐漸下降，說(shuō)明樹(shù)脂極性越強(qiáng)對(duì)冬凌草甲素的吸附作用力越強(qiáng)，而解吸附時(shí)則越困難。綜合評(píng)價(jià)各種樹(shù)脂的吸附和解吸附性能，并結(jié)合回收率， AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的分離純化效果最好，故選用AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的分離純化工藝作進(jìn)一步研究。

2.1.2 樹(shù)脂的吸附等溫曲線 稱取AB-8樹(shù)脂0.5 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL不同初始濃度的冬凌草甲素溶液，測(cè)定AB-8樹(shù)脂分別在25、35和55 ℃下的平衡吸附濃度Ce，以Ce和Qe分別為橫、縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在25～55 ℃范圍內(nèi)平衡濃度相同時(shí)，AB-8樹(shù)脂的吸附量隨溫度下降而升高，可判斷冬凌草甲素在AB-8樹(shù)脂上的吸附為放熱過(guò)程，降低溫度可以促進(jìn)AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的吸附。因此，本試驗(yàn)選取吸附溫度為25 ℃。

2.1.3 樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 精確稱取1.0 g AB-8干樹(shù)脂置于150 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL冬凌草甲素乙醇初始溶液，在25 ℃、110 r/min恒溫振蕩。間隔一定時(shí)間取3 mL（V0）上清液測(cè)定冬凌草甲素濃度（Ci），并計(jì)算吸附量（Q），經(jīng)i次取樣后，冬凌草甲素濃度（Ci）與吸附量（Q）的計(jì)算公式如下[11]：

Q=■

以吸附量Q為縱坐標(biāo)、時(shí)間t為橫坐標(biāo)繪制AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖2所示。由圖2可以看出，在開(kāi)始吸附的1.5 h內(nèi)，吸附量升高很快，2 h后開(kāi)始趨于平緩，3 h以后基本不再變化。說(shuō)明AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的吸附在3 h內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，屬于快速吸附平衡。

2.1.4 洗脫劑的選擇 冬凌草甲素屬于貝殼杉烯二萜類化合物，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，考慮到乙醚的易燃性和甲醇的毒性，本試驗(yàn)選用乙醇溶液作為解吸劑。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)冬凌草甲素的解吸附作用如圖3所示。從圖3可以看出，95%的乙醇作洗脫劑時(shí)冬凌草甲素的解吸率最大，達(dá)81.7%，且2 h內(nèi)基本達(dá)到解吸附平衡。60%和70%的乙醇在4 h后解吸率都未能達(dá)到70.0%，解吸速率相對(duì)較慢。而80%的乙醇雖然解吸率沒(méi)有95%的乙醇的大，但在2.5 h內(nèi)解吸率達(dá)到了78.0%，考慮到分離提純的經(jīng)濟(jì)性，本試驗(yàn)選用80%的乙醇作為洗脫劑。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附-解吸附特性

2.2.1 流速對(duì)泄漏曲線的影響 進(jìn)料冬凌草甲素樣品溶液濃度為0.486 mg/mL，分別以1、2、3、4 BV/h的流速進(jìn)樣，定時(shí)收集流出液，測(cè)定流出液中冬凌草甲素的濃度，并繪制泄漏曲線，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，流速較快時(shí)，流出液中冬凌草甲素濃度偏高，泄漏率也偏高。隨著流速的減緩，AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的吸附率逐漸升高，這是因?yàn)榱魉俚?，?shù)脂與樣品的接觸時(shí)間長(zhǎng)，傳質(zhì)充分，吸附完全。但流速過(guò)小會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)的需要，本試驗(yàn)選定流速為2 BV/h。另外，從圖4還可以看出，在流速2 BV/h、進(jìn)料體積約4.5 BV時(shí)，流出液濃度接近進(jìn)料濃度的一半，出現(xiàn)嚴(yán)重的泄漏，因此進(jìn)料體積以4 BV為宜。

2.2.2 進(jìn)料濃度對(duì)泄漏曲線的影響 圖5為2 BV/h流速時(shí)不同進(jìn)料濃度的冬凌草甲素樣品溶液的泄漏曲線。從圖5中可以看出，進(jìn)料濃度高時(shí)，吸附傳質(zhì)速度很高，吸附很快達(dá)到平衡。根據(jù)李坤平[12]的研究，吸附速度存在一個(gè)平衡值，吸附速度過(guò)快會(huì)造成AB-8樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的吸附率不高，而進(jìn)料濃度過(guò)低時(shí)吸附達(dá)到平衡的時(shí)間則很長(zhǎng)。綜合吸附率和吸附時(shí)間兩方面的因素，本試驗(yàn)選擇進(jìn)料濃度為0.486 mg/mL。

2.2.3 洗脫液流速對(duì)解吸附曲線的影響 用80%的乙醇溶液分別以1.0、1.5、2.0和2.5 BV/h的流速連續(xù)洗脫已經(jīng)吸附相同量冬凌草甲素的AB-8樹(shù)脂，解吸附曲線如圖6所示。從圖6可以看出，不同的洗脫速度對(duì)冬凌草甲素的洗脫效果有一定的影響，隨著洗脫劑流速的減緩，洗脫劑洗脫強(qiáng)度逐漸增加，洗脫曲線也逐漸變窄，在實(shí)際分離過(guò)程中可以提高冬凌草甲素的分離效率。另外，在流速為1.0和1.5 BV/h時(shí)，洗脫峰的峰形和峰高沒(méi)有太大的區(qū)別，而且流速為1.5 BV/h時(shí)只需3 BV的洗脫劑就可以將冬凌草甲素全部洗脫下來(lái)?？紤]到縮短生產(chǎn)時(shí)間的需要，本試驗(yàn)選用1.5 BV/h的流速為洗脫速度。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 按照上述優(yōu)化出的最佳動(dòng)態(tài)吸附-解吸附工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，所得冬凌草甲素的平均回收率為78.4%。洗脫液經(jīng)減壓濃縮后加入適量甲醇熱溶解，冷卻后析出冬凌草甲素結(jié)晶，純度為96.0%，重結(jié)晶后純度可達(dá)到99.5%，此時(shí)回收率為54.3%。

3 小結(jié)與討論

1）通過(guò)比較4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)冬凌草甲素的靜態(tài)吸附和解吸附性能，確定AB-8可以有效地分離純化冬凌草甲素。動(dòng)態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)表明，AB-8對(duì)冬凌草甲素的回收率為78.4%；用甲醇重結(jié)晶后冬凌草甲素純度達(dá)到99.5%，回收率為54.3%。

2）AB-8樹(shù)脂純化冬凌草甲素的最佳工藝參數(shù)為吸附時(shí)進(jìn)料濃度0.486 mg/mL、流速2 BV/h、進(jìn)樣量4 BV；解吸附時(shí)80%的乙醇溶液作洗脫劑、流速1.5 BV/h、洗脫劑用量3 BV。

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