絞股藍(lán)多糖對小鼠胸腺和脾臟影響的研究

摘要：采用原位末端標(biāo)記（TUNEL）、過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒（SP）技術(shù)，觀察絞股藍(lán)多糖對小鼠胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞凋亡和增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組胸腺和脾臟中均可見凋亡的淋巴細(xì)胞，細(xì)胞胞核染色質(zhì)固縮凝聚，有的形成凋亡小體。統(tǒng)計分析表明，50 mg/kg的絞股藍(lán)多糖能促進(jìn)胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖和凋亡，推論可知其可以促進(jìn)胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的更新。

關(guān)鍵詞：絞股藍(lán)多糖；小鼠胸腺；脾臟；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

中圖分類號：R967 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4156-05

The influence of Gynostemma Polysaccharide on the Spleen and Thymus of Mouse

ZHOU Shi-qiong1，LU Jun-qiu2，LI Gui-zhi2，ZHOU Yue2，WEI Xiao-rui2，WANG Xiao-li2

（1.Dalu Veterinary Station of Bishan， Bishan 402772，Chongqing，China；

2.College of Animal Science and Technology， Guangxi University，Nanning 530005，China）

Abstract： The influence of gynostemma polysaccharide on lymphocyte apoptosis and proliferation of the spleen and thymus was detected by TUNEL and SP. The results showed the apoptosis cells were found in all groups of spleen and thymus， chromatin of the cell nucleus were pyknosis and cohesion， and some even formed the apoptotic body. The statistical analysis showed that 50 mg/kg gynostemma polysaccharide could promote the lymphocyte proliferation and apoptosis of the spleen and thymus. It indicated that the Gynostemma polysaccharide could provoke the renew of the spleen and the thymus lymph cell on physiological status.

Key words： gynostemma polysaccharide； thymus； spleen； cell apoptosis； cell proliferation

收稿日期：2013-03-29

基金項目：廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研發(fā)展基金項目（DK201102）；2011年新世紀(jì)廣西高等教育教改工程項目（2011JGB006）；廣西高等

學(xué)校特色專業(yè)及課程一體化建設(shè)項目（GXTSZY141）

作者簡介：周石瓊（1985-），女，四川巴縣人，助理獸醫(yī)師，碩士，主要從事組織胚胎學(xué)的研究，（電話）18983283859（電子信箱）86370764@qq.com；

通訊作者，王曉麗（1976-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，教授，主要從事細(xì)胞、組織與胚胎工程的研究，（電子信箱）lili-fly@126.com。

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum），又名七葉膽、甘茶蔓等，味苦、性寒、無毒。主要分布于中國南部，在廣西有豐富的資源。絞股藍(lán)具有抗疲勞、抗缺氧、減肥、抗衰老、抗?jié)冏饔?，并有抑制癌?xì)胞增殖和膽結(jié)石形成的功效[1-4]。近年來的研究表明，絞股藍(lán)多糖具有非常重要的生物活性，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)對絞股藍(lán)多糖的提取和其藥用價值進(jìn)行了全面的研究，特別在其免疫效果的研究方面。但是大多數(shù)研究是就臨床效果進(jìn)行臟器指數(shù)統(tǒng)計或是進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)從而驗證其免疫能力，而沒有從體內(nèi)的細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)行研究。本試驗對小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡和增殖進(jìn)行了研究，從組織學(xué)角度研究絞股藍(lán)多糖對小鼠免疫系統(tǒng)的影響，從而驗證絞股藍(lán)多糖的免疫性能，為其開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組情況

健康昆明種小白鼠40只，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，雌雄各半，體重18.00～22.00 g。隨機(jī)分為4組，每組10只，于實驗動物房標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中飼養(yǎng)，自由采食、飲水，其他管理措施參照小鼠飼養(yǎng)管理手冊。其中1組為對照組，另外3組為試驗組。試驗組小白鼠分別注射不同濃度（50、100、200 mg/kg）的絞股藍(lán)多糖，每天腹腔注射0.5 mL/只，連續(xù)給藥7 d，對照組則注射等體積生理鹽水。各組動物于末次給藥后24 h脫臼處死，取胸腺和脾臟稱重記錄后分別進(jìn)行固定。

1.2 藥品與試劑

絞股藍(lán)多糖：于廣西大學(xué)動物科技學(xué)院藥理實驗室提?。患?xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）：Roche Applied Science，Cat.No.11 684 817 910；細(xì)胞增殖檢測試劑盒：中衫金橋（ZSGB-BIO）SP-9000/9001/9002 HistonstainTMPlis Kits；DAB試劑盒：中衫金橋（ZSGB-BIO）ZLI-9031/9032/9033；小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體：中衫金橋（ZSGB-BIO）ZM-0213。

1.3 試驗方法

絞股藍(lán)多糖含量測定：采用苯酚硫酸法。將絞股藍(lán)多糖0.1 g溶于1 000 mL的蒸餾水中，取2 mL溶液加入6%的苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm處測得吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得多糖含量。

臟器指數(shù)：小鼠脫臼處死后取其胸腺、脾臟，用濾紙吸干水分后即在分析天平上稱重，計算臟器指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重/體重；脾臟指數(shù)=脾臟重/體重。

胸腺、脾臟石蠟切片制作：梯度乙醇脫水、二甲苯∶乙醇（1∶1）浸透、二甲苯透明、石蠟包埋、修塊、切片（5 μm）、載玻片涂抹甘油蛋白撈片、50 ℃烘箱放置48 h。

原位末端標(biāo)記（TUNEL）法試劑盒檢測：切片用二甲苯清洗2次，梯度乙醇復(fù)水，PBS漂洗2次，細(xì)胞通透液8 min，PBS漂洗2次，于暗濕盒中37 ℃孵育30 min，PBS漂洗2次，于組織處加50～100 μL DAB底物，15～25 ℃反應(yīng)10 min，PBS漂洗2次，蘇木精復(fù)染幾秒鐘后用自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察，隨機(jī)選取10個視野，分別計數(shù)視野內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)，求平均值并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，拍照。

SP試劑盒檢測：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，去離子水反應(yīng)10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min，滴加試劑A（藍(lán)）于室溫下10～15 min，傾去，勿洗；滴加1∶100稀釋的一抗于37 ℃孵育2～3 h ，用PBS清洗3次，每次3 min；滴加試劑B（黃）于37 ℃孵育10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；滴加試劑C（橙）于37 ℃孵育10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；用 DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察，隨機(jī)選取10個視野 ，分別計數(shù)視野內(nèi)的增殖細(xì)胞數(shù)，求平均值并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0 for windows 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，計量數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，比較各組細(xì)胞凋亡率的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)多糖含量測定

通過苯酚硫酸法測定樣品吸光度為0.47。通過圖1中標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程計算得其多糖含量為83.4%。

2.2 絞股藍(lán)多糖對小鼠臟器指數(shù)的影響

由表1可見，50 mg/kg和100 mg/kg絞股藍(lán)多糖對正常小鼠的脾臟指數(shù)有抑制作用，與空白對照相比差異極顯著（P<0.01），其中以50 mg/kg的絞股藍(lán)多糖的抑制作用最強。絞股藍(lán)多糖對小鼠胸腺指數(shù)沒有明顯影響。

2.3 染色結(jié)果

HE染色：可見正常淋巴細(xì)胞核染色呈藍(lán)色或紫色，染色質(zhì)色澤均一。凋亡細(xì)胞胞核染色質(zhì)固縮、邊集，呈花瓣狀、半月形或凋亡小體（圖2、圖3）。

原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測結(jié)果：視野內(nèi)可見大量的TUNEL陽性細(xì)胞，其細(xì)胞核呈棕黑色，胞質(zhì)為均勻的棕黃色；周圍正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈米黃色（圖4、圖5）。

SP檢測結(jié)果：可見陽性細(xì)胞胞核呈棕色，凸顯于視野中，胞質(zhì)勻染；周圍陰性細(xì)胞呈黃色，胞質(zhì)均勻淡黃色（圖6、圖7）。

2.4 絞股藍(lán)多糖對小鼠脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的影響

由表2可見，在小鼠生理狀態(tài)下，50 mg/kg和200 mg/kg的絞股藍(lán)多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，與空白對照和100 mg/kg組相比差異極顯著（P<0.01），100 mg/kg的絞股藍(lán)多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡沒有明顯影響，可能是注射藥物引起了脾臟的應(yīng)激反應(yīng)，加快了脾臟細(xì)胞的代謝所致。50 mg/kg和100 mg/kg絞股藍(lán)多糖對生理狀態(tài)下的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，與空白對照和200 mg/kg組相比差異極顯著（P<0.01），其原因也可能是與藥物的刺激有關(guān)。

2.5 絞股藍(lán)多糖對小鼠脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表3可見，50 mg/kg和100 mg/kg的絞股藍(lán)多糖都能夠使脾臟淋巴細(xì)胞增殖增加，結(jié)合表2分析可知，絞股藍(lán)多糖能夠增加脾臟的代謝，增強脾臟細(xì)胞的更新。而50、100、200 mg/kg的絞股藍(lán)多糖對小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的增殖均有顯著的影響（P<0.05或P<0.01），能夠增加胸腺淋巴細(xì)胞的數(shù)量，通過表2與表3綜合分析表明絞股藍(lán)多糖對胸腺和脾臟的細(xì)胞更新有刺激作用。

3 小結(jié)與討論

胸腺是機(jī)體最重要的淋巴器官，其功能與免疫緊密相連，其最主要的功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞，因此其功能狀態(tài)是否正常就直接影響到機(jī)體免疫狀況的好壞。而脾臟是機(jī)體中最大的淋巴器官，占全身淋巴組織質(zhì)量的1/4，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，在異物入侵的時候可起到過濾的作用，在缺血的時候可起到補血的作用，在腫瘤發(fā)生的時候可起到抗腫瘤的作用，所以對其細(xì)胞狀況的觀察也是對機(jī)體免疫功能好壞評估的一種重要手段。本試驗是基于胸腺和脾臟在機(jī)體免疫中具有的重要地位而選取其作為免疫指標(biāo)來對絞股藍(lán)多糖的免疫效果進(jìn)行檢測。

對于生理狀態(tài)下多糖對機(jī)體免疫功能影響的研究已有很多，從植物多糖到動物多糖，其大多都具有免疫刺激的功能，并且在生理狀況下對細(xì)胞的凋亡和增殖同樣有影響。文貴輝等[5]在櫻桃谷鴨的飼料里加入了白術(shù)多糖，再檢驗其細(xì)胞增殖的狀況，結(jié)果表明添加白術(shù)多糖的櫻桃谷鴨細(xì)胞顯著增殖，而對其胸腺指數(shù)沒有顯著影響，脾臟指數(shù)在添加比例為0.6%時有顯著抑制作用。尚川川等[6]將淫羊藿多糖作為一種免疫佐劑用于雞新城疫的預(yù)防，通過免疫器官的指數(shù)測定，得出中劑量和高劑量的多糖對脾臟指數(shù)有促進(jìn)作用。廉宜君等[7]從中藥方劑中提取出了復(fù)合多糖，并且對其免疫功能進(jìn)行研究，得出該復(fù)合多糖能夠顯著提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，并且與黃芪多糖組比較也存在顯著差異。董蘭鳳等[8]對附子多糖的抗腫瘤作用研究得知其能夠明顯增大小鼠脾臟的質(zhì)量，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。王守山等[9]通過對蘆薈多糖的研究指出其能夠促進(jìn)胸腺和脾臟的發(fā)育，特別是能促進(jìn)胸腺的發(fā)育。樟芝多糖對小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)都有顯著的影響，特別是高劑量組，而且其還能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)了劑量和效應(yīng)的關(guān)系[10]。左旋咪唑黨參多糖能夠顯著提高雛雞的胸腺和脾臟指數(shù)，而且能夠使淋巴細(xì)胞顯著增殖，并且在高劑量時表現(xiàn)最為顯著[11]。在鬼臼多糖的研究中，通過不同濃度的鬼臼多糖與脾臟淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)，用MTT法測得其增殖情況證明鬼臼多糖對淋巴細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用[12]。王燁等[13]對海藻多糖進(jìn)行研究，將其添加于水中讓肉雜雞飲用，觀察其對免疫性能的影響，結(jié)果表明其能顯著提高肉雜雞免疫器官的系數(shù)，特別是脾臟指數(shù)，也可提高血淋巴細(xì)胞數(shù)量，證明其能增強肉雜雞的免疫功能。王媛媛[14]通過流式細(xì)胞儀和TUNEL等方法對吉西他濱、人參多糖進(jìn)行研究，得知其能夠抑制人A549細(xì)胞的增殖，通過Bcl-2的下調(diào)，表現(xiàn)為細(xì)胞G0/G1期的阻滯，從而使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的作用。孫延慶等[15]通過形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀等方法研究梁金菇多糖，得知其在一定的劑量內(nèi)具有誘導(dǎo)原代白細(xì)胞凋亡的作用。裙帶菜多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用十分明顯，高濃度的腫瘤抑制率可以達(dá)到69.13%，其淋巴細(xì)胞的殺瘤活性與對照組相比差異顯著，而在體內(nèi)的抗Hca-F轉(zhuǎn)移模型中，裙帶菜多糖對轉(zhuǎn)移模型小鼠腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用也很顯著，而且在流式細(xì)胞儀及免疫細(xì)胞化學(xué)分析下可知該多糖有很強的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[16]。茯苓多糖、豬苓多糖和黃芪多糖都能影響細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，但是其作用時間和劑量沒有一定的相關(guān)性，通過對鈣離子濃度的影響，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[17]。對三種昆蟲多糖的研究表明其通過靜脈注射能夠提高免疫性能[18]。豬胎盤脂多糖能夠使體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)的合成加強，促進(jìn)淋巴細(xì)胞顯著增殖，在48 h時效果最為顯著[19]。絞股藍(lán)多糖對接種肝癌Heps的小鼠肝臟和胸腺沒有影響，但是對接種肉瘤S180的小鼠的脾臟有顯著刺激促進(jìn)作用，而對兩種小鼠的淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化都沒有顯著影響[20]。絞股藍(lán)多糖能夠?qū)Νh(huán)磷酰胺處理過的小鼠淋巴細(xì)胞的增殖產(chǎn)生強烈刺激作用，說明其對免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用[21]。

在本試驗中研究了絞股藍(lán)多糖對生理狀況下小鼠胸腺及脾臟的影響。在臟器指數(shù)方面，絞股藍(lán)多糖各劑量對小鼠的胸腺指數(shù)沒有影響，而對脾臟有刺激作用，在低、中濃度的時候是抑制脾臟的生長，使其指數(shù)降低，高濃度的時候則有促進(jìn)作用。在細(xì)胞凋亡方面，低、中濃度的絞股藍(lán)多糖可使胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡數(shù)增加，低、高濃度的膠股藍(lán)多糖可使脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡數(shù)增加。同時，低、中濃度的絞股藍(lán)多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，而低、中、高濃度的絞股藍(lán)多糖均可促進(jìn)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的增殖。綜合分析可知絞股藍(lán)多糖既能促進(jìn)胸腺和脾臟的細(xì)胞凋亡也可促進(jìn)其增殖，即促進(jìn)了胸腺和脾臟細(xì)胞的更新。

參考文獻(xiàn)：

[1] 錢新華，王佾先，唐曉玲，等.絞股藍(lán)多糖對免疫功能的影響[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1998，30（1）：51.

[2] 沈愛寶，邵 健.絞股藍(lán)粗多糖抗癌作用的初步觀察[J].南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，15（1）：148.

[3] RUIJANAWATE C，KANJANAPOTHI D，AMORNLERDPISON D. The anti-gastriculcer effect of Gynostemma pentaphyllum Makino[J]. Phytomedicine，2004，11（5）：431-435.

[4] WANG Z J， LUO D H. Antioxidation activities of different fractions of polysaccharide purified from Gynostemma pentaphyllum Makino[J].Carbohydrate Polymers，2007，68（1）：54-58.

[5] 文貴輝，李麗立，張 彬.白術(shù)多糖對櫻桃谷鴨生長性能和免疫機(jī)能的影響[J].嘉應(yīng)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，27（6）：12.

[6] 尚川川，趙 毅，穆 楊.淫羊藿多糖對雛雞免疫器官及新城疫疫苗免疫效果的影響[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2009，30（4）：23-26.

[7] 廉宜君，谷新利，李炳奇.從中藥方劑中提取的復(fù)合多糖對小鼠免疫功能的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2007，39（10）：50-52.

[8] 董蘭鳳，劉京生，苗智慧，等.附子多糖對H22和S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，9（9）：14-17.

[9] 王守山，江 成，褚秀玲.蘆薈多糖提高雞免疫功能的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（29）：17927-17929，17932.

[10] 張迅捷，陳紹軍，陳冠敏.樟芝多糖對小鼠免疫功能影響的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，27（5）：79-84.

[11] 柳風(fēng)祥，李登國.左旋咪唑黨參多糖對雛雞免疫調(diào)節(jié)效果的研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2011，32（6）：66-70.

[12] 帥學(xué)宏.鬼臼多糖分離提取及免疫藥理作用研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[13] 王 燁，胡中澤.海藻多糖對肉雜雞免疫功能的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2010，16（17）：59-62.

[14] 王媛媛. 吉西他濱、人參多糖對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響[D]. 武漢：華中科技大學(xué)，2006.

[15] 孫延慶，任守義.梁金菇多糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2001，30（2）：83-85.

[16] 王 雪.裙帶菜多糖對荷瘤小鼠抗腫瘤及抗轉(zhuǎn)移作用的研究[D].大連：遼寧師范大學(xué)，2006.

[17] 羅利瓊.中藥多糖在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中抗腫瘤作用及其機(jī)理研究[D].武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院，2005.

[18] 孫 龍.三種昆蟲多糖的分離純化與免疫活性研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2007.

[19] 吳梧桐，高向東.豬胎盤脂多糖的分離純化及其對脾淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[J].生物化學(xué)雜志，1990，6（2）：111-116.

[20] 錢新華，王佾先，唐曉玲，等.絞股藍(lán)多糖對免疫功能的影響[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1998，30（1）：51-53.

[21] 唐曉玲，夏培源.絞股藍(lán)多糖對環(huán)磷酰胺處理小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，1997，5（1）：61-62.

（責(zé)任編輯 曾德芳）