桂林市公園蘇云金芽孢桿菌菌株的分離

摘要：從桂林市部分公園采集了80份土樣，分離得到11株蘇云金芽孢桿菌，并對(duì)其殺蟲(chóng)晶體蛋白的形態(tài)及表達(dá)情況進(jìn)行了研究。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)這些菌株產(chǎn)生的伴孢晶體有菱形、球形、不規(guī)則形等。利用SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明9株蘇云金芽孢桿菌表達(dá)的蛋白大小約為135 ku，5株表達(dá)蛋白大小約65 ku，1株表達(dá)蛋白大小約90 ku，1株表達(dá)蛋白大小約45 ku，5株同時(shí)表達(dá)約135 ku和65 ku兩種蛋白。產(chǎn)小菱形晶體的菌株7-4可能對(duì)美國(guó)白蛾有高毒力，值得進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；伴孢晶體；光學(xué)顯微觀(guān)察；SDS-PAGE

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）17-4107-03

Isolation of Bacillus thuringiensis from parks in Guilin

ZHU Gui-mei，LIU Jian-guo，LONG Shi-hua，HAO Zai-bin

（College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541006， Guangxi，China）

Abstract： 11 Bacillus thuringiensis（Bt） isolates were obtained from 80 soil samples collected from some parks in Guilin，and the morphology and expression of insecticidal crystal proteins from these strains were futher studied. The optical microscopic observation showed that there were bipyramidal， spherical， and irregular parasporal crystals in the 11 Bt isolates. Analysis of proteins by SDS-PAGE indicated that 9 Bt isolates could express proteins with 135 ku molecular mass， 5 strains with 65 ku， 1 strain with 90 ku， 1 strain with 45 ku， and 2 isolates expressed both 130 ku and 60 ku proteins. Strain 7-4 producing small bipyramidal crystal protein may have high toxcity to Hyphantria cunea（Drury）， which deserved to be further studied.

Key words： Bacillus thuringiensis； parasporal crystal； optical microscopic observation； SDS-PAGE

收稿日期：2013-01-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2008ZX08001-001）； 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2009CB118902）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目

（31060193）

作者簡(jiǎn)介：朱桂梅（1988-），女，廣西桂林人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)開(kāi)發(fā)與利用，（電話(huà)）15878345027（電子信箱）

e_zhuguimei@126.com；通訊作者，郝再彬（1958-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)與利用研究，

（電子信箱）haozaibin2010@126.com。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種在自然界中廣泛分布的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，是目前世界上用途最廣、應(yīng)用最成功、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲(chóng)劑[1]，可作為化學(xué)農(nóng)藥的替代品[2，3]，已成為生物農(nóng)藥研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。Bt在芽孢形成過(guò)程中，能在菌體的一端或兩端產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)形狀一致或不同的伴孢晶體（Parasporal crystal）[1，2]，又稱(chēng)殺蟲(chóng)晶體蛋白（Inseticidal crystal proteins，ICPs）或δ-內(nèi)毒素（Delta-endotoxin）[4，5]，由cry或cyt基因編碼，是Bt殺蟲(chóng)活性的主要來(lái)源[6]。研究表明，ICPs具有高效、廣譜的殺蟲(chóng)作用，對(duì)人畜及非目標(biāo)昆蟲(chóng)無(wú)害，對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目以及吸蟲(chóng)、鞭毛蟲(chóng)、線(xiàn)蟲(chóng)、螨類(lèi)和原生動(dòng)物等200多種害蟲(chóng)具有毒力作用[5，7-9]，且具有抗癌作用[10]。

由于Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白和殺蟲(chóng)基因的巨大應(yīng)用價(jià)值，許多國(guó)家如西班牙[11]、巴西[3]、土耳其[12]、韓國(guó)[13]、突尼斯[14]等將Bt新資源的收集與開(kāi)發(fā)作為重點(diǎn)，開(kāi)展大規(guī)模資源采集、分析的基礎(chǔ)性工作，期望找到高效廣譜的Bt菌，發(fā)現(xiàn)新的cry基因，并通過(guò)各種現(xiàn)代生物技術(shù)手段如基因重組、原生質(zhì)體融合等構(gòu)建高效廣譜殺蟲(chóng)工程菌、培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物。廣西桂林地形屬于喀斯特地貌，關(guān)于桂林地區(qū)的Bt研究始于2009年[15]，但迄今相關(guān)研究甚少。本研究從桂林部分公園采集的80份土樣中分離Bt菌株，分別利用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察和SDS-PAGE對(duì)Bt菌株產(chǎn)生的伴孢晶體的形態(tài)和表達(dá)進(jìn)行了分析，為豐富桂林地區(qū)的Bt資源及以后的基因型鑒定、生物活性預(yù)測(cè)、篩選出新的高效生產(chǎn)菌株、克隆新型cry基因等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。本研究以HD-1作為對(duì)照菌株。

1/2 LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，酵母提取物0.25%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%，調(diào)pH至7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

堿性復(fù)紅染色液：準(zhǔn)確稱(chēng)取堿性品紅1.00 g，置于研缽中，然后量取10 mL無(wú)水乙醇于研缽中緩慢研磨，至品紅溶解，再量取5 mL飽和酚溶液至研缽中，繼續(xù)研磨，使品紅充分溶解，最后加去離子水定容至100 mL，4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 土樣采集 從廣西桂林西山公園、疊彩山公園等公園采集土樣。設(shè)置采樣點(diǎn)，從采樣基點(diǎn)開(kāi)始每隔100 m一個(gè)樣品。采樣時(shí)虛擬一個(gè)正方形，每隔約2 m，共于8個(gè)點(diǎn)處去除表層土壤，取距表層5～10 cm處的土壤30 g混合，裝在一個(gè)無(wú)菌自封袋中作為一個(gè)樣品，標(biāo)注采樣點(diǎn)、采樣日期、編號(hào)、采樣人等信息。

1.2.2 Bt菌株分離與保存 采用溫度篩選法分離Bt菌株。取16.0 g土樣放入裝有160 mL去離子水和玻璃珠的塑料瓶中，旋渦混合器振蕩3～5 min，將土粒打碎，然后80 ℃水浴20 min，將非芽孢菌充分殺死；待靜置3 min后，稀釋菌懸液，選取10-2、10-3兩個(gè)稀釋度，分別吸取l00 μL菌懸液于1/2 LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，每個(gè)梯度設(shè)兩個(gè)平行，30℃恒溫培養(yǎng)72 h。挑選疑似Bt的菌落涂片，堿性復(fù)紅染液染色3～5 min，在16×100倍油鏡下觀(guān)察菌株伴孢晶體的有無(wú)及形態(tài)。將凡能形成伴孢晶體的菌株作為Bt菌株，劃線(xiàn)純化，-20 ℃ 10%甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SDS-PAGE 分析刮取2 mg培養(yǎng)48 h的Bt菌體于1.5 mL離心管中，用1 mL無(wú)菌水懸浮，12 000 r/min離心1 min，棄上清；用400 μL 1 mol/L NaCl重懸，12 000 r/min離心2 min，棄上清；用400 μL去離子水重懸，12 000 r/min離心2 min，棄上清，如此重復(fù)3次，離心棄上清；用50 μL去離子水懸浮，加入40 μL新配0.5 mmol/L NaOH室溫作用5 min；加入65 μL 3×上樣緩沖液，混勻后，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min。取10 μL上清液，進(jìn)行10% SDS-PAGE分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株分離

本研究從桂林部分公園采集土樣80份，結(jié)合溫度篩選法和光學(xué)顯微觀(guān)察，分離出11株野生Bt菌株（表1），出土率為13.75%。出土率相對(duì)較低，是因?yàn)閺V西桂林喀斯特地貌土壤中巖石成分比較多，含高濃度的礦物質(zhì)，土壤比較貧瘠，生物多樣性較低[15]。

2.2 伴孢晶體形態(tài)

以Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1為對(duì)照菌株，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)11株野生Bt菌株產(chǎn)生的伴孢晶體形狀有大、小菱形，大、小球形及不規(guī)則形等（表1，圖1）。伴孢晶體形態(tài)豐富，表明桂林地區(qū)可能蘊(yùn)藏著豐富的未知Bt資源。其中，2株產(chǎn)生菱形晶體，4株產(chǎn)生球形晶體，5株產(chǎn)生兩種或兩種以上形狀的晶體。而菱形與球形共存于同一菌體，這可能是由于菱形晶體蛋白被蛋白酶降解，晶體蛋白棱角被鈍化和切片位置不同造成的。

2.3 SDS-PAGE分析

以Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1為對(duì)照，按照1.2.3的方法對(duì)11株野生Bt分離菌株進(jìn)行殺蟲(chóng)晶體蛋白SDS-PAGE分析。結(jié)果如表1所示，11株分離株的蛋白圖譜如圖 2所示。結(jié)果表明，9株表達(dá)蛋白分子質(zhì)量約135 ku，5株表達(dá)蛋白分子質(zhì)量約65 ku，1株表達(dá)蛋白分子質(zhì)量約90 ku，1株表達(dá)蛋白分子質(zhì)量約45 ku，5株同時(shí)表達(dá)分子質(zhì)量約65、135 ku兩種蛋白。而產(chǎn)菱形晶體蛋白的分離株除21-9外都表達(dá)分子質(zhì)量約135 ku蛋白，可能21-9含有與其他8株不同的基因型。趙煥麗等[16]和董明等[17]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)小菱形晶體蛋白的Bt菌株對(duì)美國(guó)白蛾有較高毒力。在本研究中，產(chǎn)生小菱形晶體蛋白的菌株7-4與HD-1有相同的蛋白表達(dá)譜，預(yù)測(cè)其可能含cry基因并對(duì)美國(guó)白蛾有較高毒力，有待進(jìn)一步研究。此外，對(duì)11株Bt分離株進(jìn)行SDS-PAGE分析并未檢測(cè)到對(duì)癌細(xì)胞有殺傷力的約81 ku蛋白，與以往的報(bào)道相符合，主要是由于該基因通常是沉默的，在Bt菌株中不表達(dá)[15]。

3 結(jié)論

從桂林部分公園土壤中分離得到11株Bt分離株，豐富了桂林地區(qū)的Bt資源。通過(guò)SDS-PAGE分析，菌株21-9可能含有與其他產(chǎn)菱形晶體的分離株不同的基因型；產(chǎn)小菱形晶體的菌株7-4與標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1有相同的蛋白譜，有可能對(duì)美國(guó)白蛾有高毒力，有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 張 毅）