土壤中產(chǎn)天然維生素E真菌新資源的篩選

摘要：采用稀釋平板分離法獲得67株真菌，測(cè)定其維生素E（VE）含量，以期從土壤中篩選出富含天然VE的真菌新資源。采用高效液相色譜法進(jìn)行VE含量檢測(cè)，其中有10株真菌能產(chǎn)生天然VE；通過(guò)形態(tài)與分子系統(tǒng)學(xué)手段對(duì)10株菌株進(jìn)行鑒定，有5株菌株鑒定到種，分別屬于馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）、爪哇棒束孢（Isaria javanica）和淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum），2株菌株鑒定到屬，均為戴氏霉屬（Taifanglania）；另外3株菌株序列未測(cè)出。對(duì)其中兩株VE含量較高的菌株——馬昆德擬青霉和爪哇棒束孢從碳源和氮源方面進(jìn)行了初步的培養(yǎng)基優(yōu)化，結(jié)果表明不同的碳源、氮源對(duì)VE含量均有一定影響。

關(guān)鍵詞：真菌；新資源；篩選；天然維生素E；土壤

中圖分類號(hào)：S182；Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）17-4066-03

Screening of New Resources of Natural Vitamin E Producing Fungi from Soil

ZHANG Yan-wei1，HAN Yan-feng2，LIU Xun1，LIANG Zong-qi2

（1.School of Chemistry and Life Sciences， Guizhou Normal College， Guiyang 550018，China；

2.Institute of Fungus Resources，College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Abstract： 67 fungal strains were obtained by dilution plate； and their natural vitamin E content was determined by fluorescence spectrophotometry and HPLC to screen new resources of natural vitamin E producing fungi. 10 strains were identified as vitamin E producing fungi. According to morphology and molecular systematics， 5 strains were identified as Paecilomyces marquandii， Isaria javanica， Purpureocillium lilacinum； 2 strains belonged to Taifanglania genus； and 3 strains was not able to be sequenced. The carbon and nitrogen sources of medium for two high vitamin E producing strains， P. marquandii and I. javanica， was optimized； and results showed that different nitrogen and carbon sources affected their vitamin E content to a certain degree.

Key words： fungi； new resources； screen； natural vitamin E； soil

收稿日期：2013-04-18

基金項(xiàng)目：貴州省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2008059）

作者簡(jiǎn)介：張延威（1979-），男，山西山陰人，副教授，在讀博士研究生，研究方向?yàn)檎婢Y源與應(yīng)用，（電話）0851-5816647（電子信箱）

zyw_email@163.com。

維生素E（Vitamin E，VE）又稱生育酚， 通常為淡黃色油狀，為脂溶性物質(zhì)；在無(wú)氧或氧化劑存在時(shí)對(duì)熱、酸、堿一般穩(wěn)定，反之則氧化成醌類；對(duì)可見(jiàn)光穩(wěn)定，但可被紫外光破壞。VE是生育酚（Tocopherol）、生育三烯酚（Tocotrienol）及其能夠或多或少地顯示D-α-生育酚生物活性的一類衍生物的總稱，常見(jiàn)的有4種，即α、β、γ和δ-生育酚，其生理作用類似，其中以α-生育酚生理活性最高[1，2]。它在人體內(nèi)不能自行合成，必須從外界攝取。VE是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，在體內(nèi)可阻止自由基反應(yīng)的進(jìn)行，延緩機(jī)體衰老，維持生育功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，能將某些惡性腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為正常表現(xiàn)形的細(xì)胞，還具有維持結(jié)締組織彈性、促進(jìn)血液循環(huán)等功能[3-8]。

VE有兩種來(lái)源，即天然VE和合成VE。天然VE在結(jié)構(gòu)上純度較高，生理活性較強(qiáng)，生物利用度較好，更易于被人體吸收，且具有更高的安全性。因此，一般在涉及醫(yī)藥、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)劑、保健品、化妝品等方面更傾向于使用天然VE；合成VE則主要應(yīng)用于飼料添加劑等方面[9-11]。由于天然VE的特點(diǎn)及人們對(duì)天然綠色產(chǎn)品的青睞，天然VE的市場(chǎng)需求逐年增長(zhǎng)，尤其在藥品類和保健品類天然VE越來(lái)越受到關(guān)注[12]。

天然VE廣泛分布于動(dòng)植物組織中，主要來(lái)源是植物油及油脂加工產(chǎn)物脫臭餾出物中[13-15]。目前工業(yè)生產(chǎn)上，國(guó)內(nèi)外主要以植物油精煉加工時(shí)所得脫臭餾出物和殘?jiān)ㄔ停樵蟻?lái)提取[16，17]，由于生產(chǎn)原料來(lái)源有限，尤其是國(guó)內(nèi)其生產(chǎn)受到了制約[18]。如要更廣泛地開(kāi)發(fā)利用天然VE，新的天然VE來(lái)源顯得尤為重要。真菌易培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短，可在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)且不破壞自然資源，在生產(chǎn)應(yīng)用上有明顯優(yōu)勢(shì)。關(guān)于產(chǎn)天然VE真菌有文獻(xiàn)報(bào)道的很少，主要是幾種蟲生擬青霉類真菌[19，20]，土壤真菌也有，但含量很低[21]。土壤是真菌類群非常豐富的基質(zhì)，故本研究擬從土壤中篩選高產(chǎn)VE的真菌新資源，為天然VE的開(kāi)發(fā)利用提供一條新來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株是從不同地區(qū)采集的土壤中分離純化得到的真菌菌株，共67株，編號(hào)為MF1-MF67。

1.1.2 儀器與試劑 所用儀器有Agilent1100高效液相色譜儀、Agilent熒光分光光度計(jì)。所用試劑有甲醇、石油醚、抗壞血酸、KOH，均為國(guó)產(chǎn)分析純，VE標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 待測(cè)菌株的培養(yǎng) ①測(cè)定VE菌株的培養(yǎng)。將待測(cè)菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)15 d，取出菌絲，用濾紙吸干水分，待測(cè)。②測(cè)序菌株的培養(yǎng)。將待測(cè)菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)10 d，收集菌絲，待測(cè)。

1.2.2 VE的測(cè)定方法

1）高效液相色譜儀測(cè)定。精確稱取新鮮菌絲樣品0.5 g，烘干后用研缽粉碎，加入無(wú)水甲醇5 mL超聲30 min，0.45 μm濾膜微濾后進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為樣品重復(fù)檢測(cè)3次的均值。

色譜檢測(cè)條件：Hypersil ODS2色譜柱 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水=98∶2；流速1.0 mL/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)儀，波長(zhǎng)292 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣閥體積20 μL。

2）熒光分光光度計(jì)測(cè)定。精確稱取新鮮菌絲樣品1.0 g，加入5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的抗壞血酸水溶液5 mL，10 mol/L的KOH溶液5 mL，在水浴中加熱并振搖，溫度控制在70～80 ℃皂化15 min后移出冷卻，加去離子水定容到25 mL，用石油醚40 mL分3次萃取，合并萃取液，用去離子水洗滌萃取液至中性，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，用甲醇溶解剩下固體并定容至10 mL，過(guò)0.45 μm濾膜微濾后上樣檢測(cè)。同時(shí)稱取等量菌絲樣品，烘干后再次稱量，計(jì)算樣品水分率。將檢測(cè)結(jié)果折算為菌絲干重含量， 結(jié)果為樣品重復(fù)檢測(cè)3次的均值。

熒光檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，空白對(duì)照為甲醇。

1.2.3 菌株rDNA序列的測(cè)定與分析 將收集好的待測(cè)菌絲用DNA提取試劑盒提取其總DNA，用ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3′）引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將菌株序列與從GenBank上blast后下載的相關(guān)序列用CLUSTAL 1.83進(jìn)行序列比對(duì)，然后用MEGA 5.05中的最大簡(jiǎn)約法（MP），經(jīng)1 000次Bootstrap驗(yàn)證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 培養(yǎng)基成分對(duì)菌株VE含量的影響 以PDA培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（CK），分別添加不同的碳源、氮源，比較添加了不同成分的培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)VE量的影響。添加的碳源、氮源見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株VE檢測(cè)結(jié)果

對(duì)獲得的67株真菌菌株搖瓶培養(yǎng)后收集菌絲，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，其中有10株菌株含有VE（表2）。

2.2 產(chǎn)VE真菌菌株的鑒定

對(duì)以上10株菌株用察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。同時(shí)通過(guò)MEGA 5.05軟件MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。其中5株菌株已鑒定到種，即MF31為馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）；MF32在系統(tǒng)樹中與爪哇棒束孢（Isaria javanica）和玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）聚為一類，不能區(qū)分，結(jié)合其形態(tài)特征中的孢子特征，確定為爪哇棒束孢；MF33、MF34和MF40 均為淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。菌株MF24、MF30和MF65序列未測(cè)出，根據(jù)菌株形態(tài)特征不能確定其歸屬。菌株MF25和 MF27從形態(tài)特征和系統(tǒng)樹聚類結(jié)果表明屬于戴氏霉屬（Taifanglania），具體屬何種戴氏霉有待進(jìn)一步鑒定。

2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)菌株VE含量的影響

選取VE含量高且在搖瓶培養(yǎng)中菌絲量大、生長(zhǎng)快的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)表2檢測(cè)結(jié)果及菌株在搖瓶培養(yǎng)中菌絲生長(zhǎng)情況，選取MF31和MF32兩株菌株按照表1添加不同的碳源和氮源，分組搖瓶培養(yǎng)，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其菌絲干重VE含量，結(jié)果如表3所示。培養(yǎng)基中加尿素后兩菌株均不能生長(zhǎng)，故表中無(wú)尿素?cái)?shù)據(jù)。由表3可以看出，PDA培養(yǎng)基（CK）培養(yǎng)后，MF32的干菌絲VE含量明顯高于MF31，當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同碳源、氮源后對(duì)兩菌株菌絲的VE含量有明顯影響。對(duì)于MF31，添加兩種碳源后其菌絲VE含量降低，尤其是添加甘露糖后，其VE含量?jī)H為對(duì)照的1/5；而添加兩種氮源后，其菌絲VE含量明顯升高。對(duì)于MF32，兩種碳源對(duì)其菌絲VE含量影響不是很明顯，而添加兩種氮源后，其菌絲VE含量明顯下降。

3 討論

從67株真菌菌株中檢測(cè)出有10株菌株產(chǎn)VE，檢出率為14.93%，可見(jiàn)在土壤中產(chǎn)VE的真菌數(shù)量并不少，從土壤中尋找新的天然VE資源是可行的。在培養(yǎng)基成分試驗(yàn)中，VE含量最高可達(dá)1 167.88 μg/g（DW）。而該試驗(yàn)僅是從碳源和氮源方面做了初步的探究，相信通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件或采用誘變等其他技術(shù)手段，其VE含量還有提高的可能，可見(jiàn)從土壤中篩選出具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值菌株的可能性是有的。

在培養(yǎng)基成分對(duì)菌株VE含量的影響的試驗(yàn)中，VE檢測(cè)采用的是熒光分光光度計(jì)測(cè)定法。其原理是VE中的α-生育酚的分子結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán)，因此具有熒光，且其熒光強(qiáng)度與樣品中VE含量呈正比[22]。由于VE是一類衍生物的總稱，每種同系物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度不相同，用固定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)所測(cè)定的值與VE總含量的真實(shí)值之間是有誤差的。在本試驗(yàn)中測(cè)出的VE含量實(shí)際上是α-生育酚的含量，加之樣品經(jīng)過(guò)皂化VE含量會(huì)有損失，故其VE總含量應(yīng)該更高。

綜上所述，可知從土壤中尋找新的天然VE資源是一條值得考慮的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 韓燕峰，梁宗琦，劉愛(ài)英.天然維生素E 的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31（4）：70-72.

[2] 姚 忠，吳守一，馬海樂(lè)，等.維生素E及其提取工藝研究進(jìn)展[J].江蘇理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19（5）：18-23.

[3] 尤 新.天然維生素E的功能和開(kāi)發(fā)前景[J].食品工業(yè)科技，2000， 21（4）：5-6.

[4] 周筱丹，董曉芳，佟建明.維生素E的生物學(xué)功能和安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22（4）：817-822.

[5] 曹春暉.淺談維生素E[J].滄州師范專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2008，24（2）：48-49.

[6] 袁明雪，黃象男，韓紹印，等.天然維生素E的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2008，25（3）：13-15.

[7] 雷炳福，孫文登.維生素E的生理作用與營(yíng)養(yǎng)[J].陜西糧油科技，1996，21（3）：19-23.

[8] 皮靜勤.維生素E的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001， 10（8）：786-788.

[9] 梁 誠(chéng).合成維生素E生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].廣西化工，2001， 30（2）：21-24.

[10] 梁 誠(chéng).天然維生素E生產(chǎn)現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[J].四川化工與腐蝕控制，2002，5（5）：26-29.

[11] 張 倫.維生素E的應(yīng)用、生產(chǎn)和市場(chǎng)狀況[J].中國(guó)藥房，2000， 11（1）：5-7.

[12] 石 玲，吳幼萍，邱家學(xué).藥品類天然維生素E市場(chǎng)前景探析[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2010（24）：150-151.

[13] 劉志誠(chéng)，于守祥.營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)[M]. 第二版.北京：人民出版社，1988.

[14] D·斯沃恩，貝雷.貝雷：油脂化學(xué)與工藝學(xué)（第一冊(cè)）[M].第四版.秦洪萬(wàn)，譯.北京：輕工業(yè)出版社，1989.

[15] 劉愛(ài)英，梁宗琦，曹 蕾.古尼蟲草人工培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)成份含量分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991（2）：5-8.

[16] 宋國(guó)安.開(kāi)發(fā)天然維生素E市場(chǎng)前景廣闊[J].山東食品科技，2001（3）：27-28.

[17] 雷炳福.我國(guó)天然維生素E產(chǎn)業(yè)化前景初探[J].中國(guó)油脂，2003， 28（4）：49-51.

[18] 朱圣東，吳 迎.我國(guó)天然維生素E工業(yè)所面臨的挑戰(zhàn)[J].中國(guó)油脂，2001，26（2）：14-16.

[19] 韓燕峰，梁宗琦，周禮紅.古尼蟲草Cordyceps gunnii無(wú)性型菌絲體中天然VE提取工藝研究[J]. 貴州大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（4）：371-374.

[20] 張延威，韓燕峰，梁建東，等.5種蟲生擬青霉高產(chǎn)VE菌株的篩選及優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）：1314-1315.

[21] 韓燕峰，梁宗琦，劉愛(ài)英，等.中國(guó)擬青霉屬的兩個(gè)新記錄種[J].菌物研究，2003，1（1）：49-51.

[22] 文小青，楊月欣.食物中維生素A、葉酸和維生素E分析方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2004，16（1）：65-70.