小麥穎果與根部Cathepsin B—like蛋白的初步研究

摘要：利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了小麥（Triticum aestivum L.）灌漿時(shí)期穎果內(nèi)以及苗期根部原生韌皮部Cathepsin B-like蛋白的分布以及活性變化。結(jié)果表明，在開花后1～9 d的小麥穎果內(nèi)，Cathepsin B-like蛋白主要分布在內(nèi)果皮細(xì)胞以及灌漿池兩側(cè)的維管束中；在開花后12～24 d的穎果中，糊粉層內(nèi)的Cathepsin B-like蛋白含量逐漸增加，兩側(cè)維管束細(xì)胞中的Cathepsin B-like蛋白消失，穎果背部?jī)?nèi)果皮細(xì)胞的Cathepsin B-like蛋白含量減少并在細(xì)胞邊緣出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；在小麥苗期根部的原生韌皮部中，隨著韌皮部篩分子的成熟，篩分子內(nèi)的Cathepsin B-like蛋白含量逐漸下降直至消失。

關(guān)鍵詞：Cathepsin B-like蛋白；小麥（Triticum aestivum L.）；穎果；根部；發(fā)育

中圖分類號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）17-4044-04

Preliminary Research on Cathepsin B-like Protein in Triticum aestivum L.

Caryopsis and Root

LIU Yanga，ZHOU Zhu-qinga，MEI Fang-zhub，ZHOU Guang-shengb，CAI Jing-tonga，YANG Wen-lia，ZHANG Zhi-huia

（a.College of Life Sciences and Technology；b.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： Immunohistochemical technique was used to observe the distribution and activity variation of cathepsin B-like protein in wheat（Triticum aestivum L.） caryopsis during grain filling period and protophloem of roots during seedling stage. Results showed that in wheat caryopsis 1～9 d after flowering， cathepsin B-like proteins mainly distributed in vascular bundles of endocarp cells and both sides of grouting tank. In caryopsis 12～24 d after flowering， cathepsin B-like protein gradually increased in aleurone layer， while disappeared in both sides of vascular bundles， and reduced in endocarp cells of caryopsis back and concentrated in periphery of cells. In protophloem of roots at seedling stage， cathepsin B-like proteins gradually decreased in sieve elements（SEs） and finally disappeared as SEs matured.

Key words： cathepsin B-like protein； wheat（Triticum aestivum L.）； caryopsis； root； development

收稿日期：2013-02-01

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171469；31071347）

作者簡(jiǎn)介：劉 陽（1985-），男，河南鞏義人，碩士，研究方向?yàn)槟婢持参锛?xì)胞生物學(xué)，（電話）15527830798（電子信箱）zhuoya472@126.com；

通信作者，周竹青（1965-），男，湖北安陸人，教授，博士，從事作物生理與細(xì)胞生物學(xué)研究，（電子信箱）zhouzhuqing@mail.hzau.edu.cn。

哺乳動(dòng)物中廣泛存在著一類被稱作Cathepsin B的蛋白酶[1]，它是木瓜蛋白酶類超家族中的一員[2]，一般存在于動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體中[3]。Johnson[4]指出Cathepsin B可能在一些細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮某種特殊作用。在該類凋亡過程中，常見的Caspase類蛋白無法達(dá)到預(yù)期目的。Leist等[3]指出Cathepsin B是一種在動(dòng)植物中高度保守的Papain-like半胱氨酸蛋白酶。Cejudo等[5]在小麥（Triticum aestivum L.）中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與Cathepsin B蛋白結(jié)構(gòu)具有高度相似性的蛋白質(zhì)，并在萌發(fā)小麥的糊粉層中觀察到了該Cathepsin B-like蛋白對(duì)應(yīng)mRNA的積累，該Cathepsin B-like蛋白受GA調(diào)節(jié)，其在植物細(xì)胞中的作用目前還不確定。但目前為止對(duì)灌漿期內(nèi)小麥穎果以及苗期小麥根部原生韌皮部中Cathepsin B-like蛋白的分布及活性變化尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)小麥穎果與根部發(fā)育過程中Cathepsin B-like蛋白分布以及活性變化進(jìn)行觀察，以期為小麥發(fā)育過程的系統(tǒng)研究進(jìn)一步提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以小麥品種華麥8號(hào)為材料，溫室培養(yǎng)，室溫18 ℃。小麥開花當(dāng)天掛牌標(biāo)記開花麥穗，用記號(hào)筆點(diǎn)穎的方法標(biāo)記穗中部開花小穗。在開花后不同時(shí)間段選取標(biāo)記小穗第一、第二粒位穎果作為試驗(yàn)材料。另外取適量種子，蒸餾水清洗后以1%～3% H2O2處理5 min。蒸餾水清洗2～3遍后水中浸泡3 h。將吸足水分的種子在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3～5 d后取根尖包括根冠在內(nèi)約7 mm的區(qū)段進(jìn)行石蠟包埋。

1.2 方法

將取得的根尖以及穎果材料用含有甘油的FAA固定8 h左右，石蠟包埋、切片，切片厚度7～10 μm。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗后用PBS浸泡5 min。3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，3 min×3次。5%～10%正常羊血清進(jìn)行封閉，室溫下孵育10 min。孵育后傾去血清，勿沖洗，滴加適當(dāng)比例（1∶100）稀釋后的一抗（Santa Cruz），4 ℃下過夜。PBS沖洗，3 min×3次。滴加適當(dāng)比例（1∶100）稀釋過的生物素標(biāo)記的二抗（1% BSA-PBS稀釋），37 ℃下孵育10～30 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加適當(dāng)比例（1∶100）稀釋過的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（1% BSA-PBS稀釋），37 ℃下孵育10～30 min。PBS沖洗，3 min×3次。之后DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DAB顯色試劑盒）顯色。最后用自來水充分沖洗，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以血清孵育后不滴加一抗為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cathepsin B-like蛋白在穎果中的分布與變化

2.1.1 Cathepsin B-like蛋白在糊粉層與內(nèi)果皮中的分布與變化 在開花后1 d的小麥穎果中（圖1A），內(nèi)果皮細(xì)胞開始在灌漿池外緣出現(xiàn)；該時(shí)期的內(nèi)果皮細(xì)胞尚未出現(xiàn)伸長(zhǎng)現(xiàn)象，胞內(nèi)有強(qiáng)烈的Cathepsin B-like蛋白免疫陽性反應(yīng)，同時(shí)期的果皮細(xì)胞只有零星陽性反應(yīng)；糊粉層在該時(shí)期尚未形成。在開花后3 d的穎果中（圖1B），內(nèi)果皮細(xì)胞仍然未出現(xiàn)伸長(zhǎng)，胞內(nèi)有強(qiáng)烈的Cathepsin B-like蛋白免疫陽性反應(yīng)；此時(shí)的果皮中只有零星細(xì)胞的細(xì)胞核還保持完整，核內(nèi)有一定強(qiáng)度的陽性信號(hào)；糊粉層開始形成，但形態(tài)特征不明顯。開花后9 d的穎果中（圖1C），內(nèi)果皮細(xì)胞開始伸長(zhǎng)，胞內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)烈的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)；此時(shí)果皮細(xì)胞的情況與開花后3 d時(shí)類似；糊粉層形成，細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞核中有一定強(qiáng)度的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)，該信號(hào)的強(qiáng)度和含量都低于內(nèi)果皮細(xì)胞。在開花后12 d的穎果中（圖1D），內(nèi)果皮細(xì)胞繼續(xù)伸長(zhǎng)，胞內(nèi)Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)強(qiáng)烈，分布均勻；果皮細(xì)胞中的細(xì)胞核已基本解體，細(xì)胞質(zhì)皺縮，只有少量陽性信號(hào)反應(yīng)；糊粉層中的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)開始增強(qiáng)，其在糊粉層細(xì)胞中的分布已不局限于細(xì)胞核，而是均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中，信號(hào)強(qiáng)度低于內(nèi)果皮細(xì)胞。開花后14 d的穎果中（圖1E），內(nèi)果皮細(xì)胞的形狀開始變得不規(guī)則，胞內(nèi)Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)強(qiáng)烈，分布不均勻，開始向細(xì)胞邊緣收縮聚集；果皮細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)已基本解體，觀察不到陽性信號(hào)；糊粉層細(xì)胞內(nèi)Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)的強(qiáng)度和分布與開花后12 d時(shí)類似。開花后16 d的穎果中（圖1F），內(nèi)果皮、果皮細(xì)胞中的陽性信號(hào)強(qiáng)度和分布與開花后14 d時(shí)類似，糊粉層中的陽性信號(hào)強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)。開花后18 d的穎果中（圖1G），內(nèi)果皮細(xì)胞的陽性信號(hào)只分布在細(xì)胞的邊緣區(qū)域，糊粉層細(xì)胞陽性信號(hào)強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)，強(qiáng)度與內(nèi)果皮細(xì)胞中的信號(hào)一致。開花后24 d的穎果中（圖1H），內(nèi)果皮細(xì)胞的陽性信號(hào)主要分布在細(xì)胞的邊緣區(qū)域，強(qiáng)度和含量均有所下降，糊粉層細(xì)胞陽性信號(hào)強(qiáng)度超過內(nèi)果皮細(xì)胞。圖1I為不加一抗的對(duì)照。

2.1.2 Cathepsin B-like蛋白在穎果維管束中的分布與變化 在開花后1 d小麥穎果的兩側(cè)維管束中（圖2A），薄壁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有Cathepsin B-like蛋白的免疫陽性信號(hào)，其中細(xì)胞核內(nèi)的陽性信號(hào)強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)；在開花后6 d的穎果兩側(cè)維管束中（圖2B），薄壁細(xì)胞胞質(zhì)中的陽性信號(hào)已觀察不到，只有核中還有較為強(qiáng)烈的陽性信號(hào)；在開花后9 d的穎果兩側(cè)維管束中（圖2C），薄壁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均已沒有陽性信號(hào)。在之后的發(fā)育過程中則觀察不到明顯的穎果兩側(cè)維管束。

在開花后1 d的穎果背部維管束中（圖2D），陽性信號(hào)較弱，且沒有明顯的特異性；在開花后14 d的穎果背部維管束中（圖2E），合點(diǎn)細(xì)胞和木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中出現(xiàn)了強(qiáng)于周邊細(xì)胞的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)；在開花后24 d（圖2F）的穎果背部維管束中，合點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)的陽性信號(hào)開始消失，而木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中依舊保留有一定的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)。

2.2 Cathepsin B-like蛋白在根部原生韌皮部篩分子中的分布與變化

在距根尖頂端343 μm處的根部組織中（圖3A），原生韌皮部篩分子與其伴胞內(nèi)均有強(qiáng)烈的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)，該信號(hào)在篩分子與伴胞中的分布相對(duì)均勻，強(qiáng)度與周圍細(xì)胞一致；在距根尖頂端427 μm處的組織中（圖3B），原生韌皮部篩分子內(nèi)陽性信號(hào)的分布開始收縮，強(qiáng)度與伴胞和周圍細(xì)胞中的信號(hào)強(qiáng)度一致；在距根尖頂端462 μm處的組織中（圖3C），原生韌皮部篩分子內(nèi)的陽性信號(hào)分布變化不大，但強(qiáng)度開始衰弱；在距根尖頂端525 μm處的組織中（圖3D），原生韌皮部篩分子內(nèi)只能觀察到微弱的陽性信號(hào)；在距根尖頂端602 μm處的組織中（圖3E），原生韌皮部篩分子內(nèi)已觀察不到任何陽性信號(hào)反應(yīng)，伴胞內(nèi)的陽性信號(hào)仍然比較強(qiáng)烈，與周圍細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度一致；在距根尖頂端889 μm處的根部組織中（圖3F），原生韌皮部周圍薄壁細(xì)胞的陽性信號(hào)開始消失，伴胞內(nèi)可以觀察到較強(qiáng)的陽性信號(hào)。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在小麥穎果內(nèi)果皮、糊粉層、穎果兩側(cè)維管束、穎果合點(diǎn)細(xì)胞、穎果背部木質(zhì)部導(dǎo)管以及根部原生韌皮部篩分子的發(fā)育過程中都有Cathepsin B-like蛋白的參與。這些部位的細(xì)胞均已被證實(shí)發(fā)生了細(xì)胞程序性死亡過程（Programmed cell death，PCD）。Vercher等[6]在豌豆中觀察到內(nèi)果皮細(xì)胞在發(fā)育過程中有伸長(zhǎng)現(xiàn)象，在伸長(zhǎng)過程中，細(xì)胞質(zhì)密度下降，液泡增大，并發(fā)生了一系列退化事件，包括質(zhì)體丟失、高爾基體退化等現(xiàn)象，最終胞內(nèi)內(nèi)含物消失，細(xì)胞死亡，形成厚壁組織。糊粉層由胚乳的表層細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)化而來，在子粒的萌發(fā)過程中，胚會(huì)釋放出赤霉素，誘導(dǎo)糊粉層產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等水解酶類，分解胚乳中蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)[7]，為胚的生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，之后糊粉層則發(fā)生程序性細(xì)胞死亡[8，9]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，小麥韌皮部篩分子發(fā)育過程中細(xì)胞器發(fā)生有序解體，同時(shí)檢測(cè)到呈TUNEL陽性反應(yīng)的細(xì)胞核，還有細(xì)胞核降解等一系列細(xì)胞學(xué)事件[10]，與經(jīng)典的植物細(xì)胞PCD特征類似[11]，說明篩分子發(fā)育是一種PCD過程；木質(zhì)部導(dǎo)管的形成也已被證明屬于典型的PCD過程[12，13]。Kladnik等[14]通過DAPI、TUNEL檢測(cè)以及電子顯微鏡觀察證實(shí)，玉米合點(diǎn)細(xì)胞的發(fā)育過程中出現(xiàn)了DNA片段化、質(zhì)膜解體等PCD特征，并推測(cè)該過程可能與木質(zhì)部導(dǎo)管的PCD過程類似。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在上述組織細(xì)胞發(fā)生PCD之前，其細(xì)胞內(nèi)的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)在分布和強(qiáng)度上都會(huì)達(dá)到一個(gè)高峰期，該時(shí)期的Cathepsin B-like蛋白陽性信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)均勻分布，信號(hào)反應(yīng)強(qiáng)烈。隨著PCD進(jìn)程的開始，陽性信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的分布減少，信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱直至消失，推測(cè)Cathepsin B-like蛋白含量和活性的變化對(duì)PCD進(jìn)程的推進(jìn)產(chǎn)生了影響。糊粉層的PCD進(jìn)程在種子萌發(fā)期開始，將在以后進(jìn)一步研究。

在由無血清培養(yǎng)引起的PC12細(xì)胞的凋亡過程中，過表達(dá)Cathepsin B的細(xì)胞增強(qiáng)了生存活力；而CA074（Cathepsin B的特異性抑制劑）或者Cathepsin B的反義寡核苷酸片段可以引起細(xì)胞的主動(dòng)死亡。這些結(jié)果表明細(xì)胞中可能存在一條由Cathepsins調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡途徑，而Cathepsin B則抑制了該死亡，增強(qiáng)了細(xì)胞活性[2]。

張文虎[15]認(rèn)為糊粉層中貯存著大量的脂類物質(zhì)，細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞之間緊密排列并具有生命活性，可以對(duì)微小的環(huán)境變化做出相應(yīng)反應(yīng)，從而維持胚乳營(yíng)養(yǎng)成分長(zhǎng)期不變。糊粉層的這種作用要求糊粉層細(xì)胞在種子萌發(fā)之前的相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都保持細(xì)胞活性。筆者在糊粉層的發(fā)育過程中觀察到了Cathepsin B-like蛋白的增加和積累，從這一個(gè)方面也證實(shí)了Cathepsin B-like蛋白抑制細(xì)胞的程序性死亡，維持細(xì)胞活性的推論。結(jié)合以上結(jié)果和分析，推測(cè)Cathepsin B-like蛋白具有維持細(xì)胞活性、推遲PCD進(jìn)程的作用。隨著其在細(xì)胞中含量和活性的減少，植物發(fā)育所需的PCD進(jìn)程才得以推進(jìn)。

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