外植體和植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響

摘要：以盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）莖段和葉片為外植體，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，莖段作外植體更有利于盾葉薯蕷愈傷組織的誘導(dǎo)，最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)30 d時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，愈傷組織為淺黃色、質(zhì)地疏松、顆粒狀；以葉片為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA時(shí)誘導(dǎo)率最高，為93.75%。盾葉薯蕷愈傷組織的生長曲線呈“S”型，0～12 d為延遲生長期，增重緩慢；12～30 d為指數(shù)生長期，生長旺盛，增殖迅速；30～36 d為緩慢生長期，因此誘導(dǎo)的愈傷組織需在接種后30 d內(nèi)繼代培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）；外植體；植物生長調(diào)節(jié)劑；愈傷組織

中圖分類號(hào)：S632.1；S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3693-04

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）是薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞草本植物，又名黃姜，火頭根等，為中國特有種[1]，主要分布于四川、湖北、湖南、云南和陜西等地[2]，其根莖富含的薯蕷皂素是合成甾體激素和甾體避孕藥的主要原料[3]，可用于治療冠心病和心血管病，也可用于抗癌、防衰老、避孕和治療多種疾病，還是滅殺釘螺、防治血吸蟲的理想藥物，在醫(yī)藥界有“藥用黃金”的美稱。由于早些年只采不栽，已使盾葉薯蕷野生資源面臨枯竭[4]。合理開發(fā)利用盾葉薯蕷資源，改變其資源短缺的局面十分迫切。盾葉薯蕷的人工栽培雖緩解了薯蕷皂素生產(chǎn)中原料不足的矛盾，但普遍存在薯蕷皂素含量低和種質(zhì)退化的問題[5]。因此，選育薯蕷皂素含量高的盾葉薯蕷優(yōu)良單株，并建立高效的快速繁殖體系在盾葉薯蕷商業(yè)化栽培中具有重要意義。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)藥用植物進(jìn)行品種的改良及快速繁殖，可以更加方便、快捷和大量地得到有效成分含量較高的植株，具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究以盾葉薯蕷試管苗的莖段和葉片為外植體，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并繪制愈傷組織的生長曲線，以期為盾葉薯蕷優(yōu)良高產(chǎn)無性系的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盾葉薯蕷試管苗來自河南師范大學(xué)“四大懷藥”組織培養(yǎng)研究室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組的誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上將試管苗葉片切成面積約0.5 cm×0.5 cm的小塊，莖段切成長1.5 cm左右的小段，分別接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，含3%的蔗糖和0.6%的冷凝脂，調(diào)pH為6.0，121 ℃滅菌20 min，分別添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合2，4-D（0.5、1.0、1.5 mg/L）+6-BA（0.5、1.0 mg/L）或NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）+6-BA（0.5、1.0 mg/L）。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度（25±2） ℃、光照度2 000 lx、光照時(shí)間14 h/d。觀察愈傷組織的生長情況，30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)并記錄愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織量和愈傷組織生長情況。

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%。

1.2.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)及生長曲線的繪制 將誘導(dǎo)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每瓶接種3.0 g。接種后每3天取樣1次，每次隨機(jī)選取3瓶材料，稱其鮮重，取平均值，以愈傷組織增重量（g/L）為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)繪制愈傷組織的生長曲線。

愈傷組織增重量（g/L）=收獲量（g/L）-接種量（g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以長1.5 cm左右的莖段作外植體，分別接種在含不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種后8 d莖段兩端出現(xiàn)膨大跡象，部分莖段從中央開始膨大；11 d后從膨大處誘導(dǎo)出白色、顆粒狀的愈傷組織（圖1A）；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織的量也逐漸增多，逐漸覆蓋住整個(gè)莖段，愈傷組織顏色和質(zhì)地也有變化（圖1B）。30 d時(shí)盾葉薯蕷莖段外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況見表1。從表1可以看出，6-BA濃度相同時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的升高呈升高趨勢(shì)，而2，4-D或NAA濃度相同時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的升高總體呈升高趨勢(shì)。其他條件相同時(shí)，添加NAA與6-BA的培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率和愈傷組織量均低于添加2，4-D與6-BA的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率最高為93.75%，最低僅為75.00%。培養(yǎng)基中添加1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)100.00%，愈傷組織淺黃色、質(zhì)地疏松、呈顆粒狀，且誘導(dǎo)形成的愈傷組織量也較大。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以面積約為0.5 cm×0.5 cm的葉片作外植體，分別接種在含不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。觀察發(fā)現(xiàn)，接種后9 d葉片邊緣切口處開始褪綠、卷曲并膨大；12 d時(shí)開始出現(xiàn)少量白色顆粒狀愈傷組織（圖2A）；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織的量也逐漸增加，在葉片中央也逐漸開始形成白色點(diǎn)狀的愈傷組織（圖2B）。有部分葉片不能誘導(dǎo)形成愈傷組織，葉片在培養(yǎng)過程中逐漸變黃、變褐，然后死亡。30 d時(shí)盾葉薯蕷葉片外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況見表2。從表2可以看出，培養(yǎng)基中添加NAA和6-BA時(shí)，葉片外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，最高為56.25%，最低僅為27.78%。培養(yǎng)基中添加2，4-D和6-BA，葉片外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，6-BA濃度一定時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的升高呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而2，4-D濃度相同時(shí)，培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)效果比添加0.5 mg/L 6-BA時(shí)差。培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑組合為1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為93.75%，愈傷組織呈淺黃色、質(zhì)地疏松、顆粒狀，且誘導(dǎo)形成的愈傷組織量也較大。

2.3 愈傷組織生長曲線的繪制

盾葉薯蕷愈傷組織的生長曲線見圖3。從圖3可以看出，盾葉薯蕷愈傷組織的生長曲線呈“S”型，可分為延遲生長期、指數(shù)生長期和緩慢生長期3個(gè)時(shí)期。0～12 d為延遲生長期，愈傷組織增重緩慢，可能是由于接種初期愈傷組織對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分吸收不充分所致。12～30 d為指數(shù)生長期，愈傷組織生長旺盛，增殖迅速。隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，愈傷組織生長逐漸變慢，并開始出現(xiàn)衰老跡象，愈傷組織進(jìn)入緩慢生長期（30～36 d）。因此，愈傷組織需在培養(yǎng)后30 d內(nèi)繼代，以保持其旺盛的分裂能力和細(xì)胞活性。

3 小結(jié)與討論

3.1 外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

已有的研究結(jié)果表明，盾葉薯蕷不同類型外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效果并不相同。本試驗(yàn)用盾葉薯蕷的莖段和葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，且莖段作為外植體時(shí)誘導(dǎo)效果要優(yōu)于葉片。李瓊等[6]分別以盾葉薯蕷莖尖、葉片和幼嫩果莢為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莖尖外植體出愈率高，不易污染，且愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間短，是組織培養(yǎng)較理想的外植體材料。莫英等[7]比較了莖段、葉片和葉柄對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)形成的影響，結(jié)果也認(rèn)為以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果最佳。綜合看來，莖段或莖尖更適合作為誘導(dǎo)盾葉薯蕷愈傷組織的外植體。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

生長素類物質(zhì)是最早被發(fā)現(xiàn)的植物激素[8]，它作為一類重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，影響細(xì)胞的分裂、伸長、細(xì)胞形態(tài)建成、根的發(fā)育、頂端優(yōu)勢(shì)以及對(duì)光和重力的響應(yīng)等多種生理過程[9]。NAA在較低濃度下促進(jìn)細(xì)胞生長，在高濃度下促進(jìn)細(xì)胞成熟衰老。本研究結(jié)果表明，在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的生長素濃度范圍內(nèi)（2，4-D 0.5～1.5 mg/L，NAA 0.5～1.5 mg/L），2，4-D促進(jìn)盾葉薯蕷莖段和葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)的效果要好于NAA，添加1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中莖段外植體愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%。晏嬰才等[10]認(rèn)為，在0.5～2.0 mg/L范圍內(nèi)，2，4-D誘導(dǎo)盾葉薯蕷愈傷組織的效果明顯優(yōu)于NAA；在6-BA的濃度相同的情況下，同濃度2，4-D的誘導(dǎo)率顯著高于NAA，這與本研究的結(jié)果是一致的。

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