東北白樺COMT1基因克隆及其植物表達載體構建

摘要：采用同源克隆法結合cDNA末端快速擴增（RACE）技術克隆東北白樺（Betula platyphylla）咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉移酶（COMT）基因COMT1，測序結果顯示東北白樺COMT1 cDNA序列全長

1 367 bp（GenBank登錄號：KC292201），其中完整編碼區(qū)長度1 095 bp，編碼365個氨基酸。利用Gateway技術分別構建了東北白樺COMT1植物過量表達和反義表達載體。

關鍵詞：東北白樺（Betula platyphylla）；咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉移酶（COMT）；克??；載體構建

中圖分類號：S792.153 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3690-03

木質素（Lignin）是酚類多聚體，其在植物體內的含量僅次于纖維素[1，2]。因聚合前單體（香豆醇、松柏醇、芥子醇）不同，木質素可分為紫丁香基木質素（S型木質素）、愈創(chuàng)木基木質素（G型木質素）和對-羥基苯基木質素（H型木質素）3種。裸子植物木質素主要為G型，雙子葉植物主要含G型和S型木質素，單子葉植物則含G型、S型和H型木質素[3]。木質素的生物合成分為3個階段：光合同化產物形成苯丙氨酸，苯丙氨酸代謝生成木質素單體以及單體聚合形成不同類型的木質素。木質素單體合成途徑中存在多種代謝關鍵酶類，如苯丙氨酸氨解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），阿魏酸-5-羥基化酶（Ferulate 5-hydroxylase，F5H），咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉移酶（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT），咖啡酰輔酶-A-O-甲基轉移酶（Caffeoyl-CoAO-methyltransferase，CCoAOMT）和肉桂酰CoA還原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）等，該途徑也是目前木質素調控研究的重點[4，5]。COMT催化咖啡酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇甲基化分別生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，參與S型木質素的合成，裸子植物中COMT只催化咖啡酸[6]。研究表明COMT是S型木質素合成中的關鍵酶，而且與G型木質素向S型木質素的轉化密切相關[7]。此外，擬南芥comt突變體更容易被細菌和真菌所感染[8]，反義抑制COMT1與CCoAOMT表達均使轉基因煙草植株木質素含量下降，且兩個基因同時被抑制時下降輻度更大[9，10]。

東北白樺（Betula platyphylla）是耐寒、喜光、耐貧瘠的樹種，具有生長快、適應性強和用途廣泛等特點，是我國北方重要樹種之一[11]。然而東北白樺木材存在材性脆、韌性弱和密度較低等問題，對東北白樺材質材性進行遺傳改良是目前研究的熱點。本研究克隆東北白樺COMT1基因全長序列，構建東北白樺COMT1基因植物過量表達和反義表達載體，以期為東北白樺材質材性的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 pENTR/SD/D-TOPO和TOP10感受態(tài)細胞購自Invitrogen公司，pMD18-T載體購自TaKaRa公司，pGWB2載體、DH5α和農桿菌感受態(tài)為東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室自制。

1.1.2 植物材料 3個月苗齡的東北白樺苗種植于東北林業(yè)大學實驗林場，采集幼嫩葉片用于植物總RNA的提取。

1.1.3 主要試劑 pBIOZOL購自博日科技有限公司，LA-Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTP、RNA LA PCRTM Kit反轉錄試劑盒及3′-Full Race Kit購于TaKaRa公司，Silica Bead DNA Gel Extraction Kit購自Fermentas公司，質粒小提試劑盒購于Promega公司，Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix購自Invitrogen公司，卡那霉素、潮霉素、慶大霉素、利福平購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 東北白樺總RNA的提取及cDNA的合成

將東北白樺材料在液氮中研磨至粉末，用小勺取0.1 g粉末至離心管中，采用pBIOZOL提取總RNA，具體操作步驟詳見其說明書，得到的總RNA用適量的無RNase水溶解，采用紫外分光光度計測定RNA濃度與純度。用RNA LA PCRTM Kit反轉錄合成第一鏈cDNA，具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.2.2 東北白樺COMT1正義和反義片段的克隆

TGGTG-3′），以東北白樺總cDNA作模板，PCR擴增出東北白樺COMT1序列核心片段。采用cDNA末端快速擴增（Rapid Ampliphication of cDNA Ends，RACE）獲取COMT1全長序列，3′RACE擴增引物為D1，5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′；D2，5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTT-3′。具體操作按3′-Full Race Kit說明書進行。

TTCCATGAT-3′。PCR擴增反應體系為：2.0 μL 10×Buffer、上下游引物各0.5 μL、2.0 μL dNTPs、1.0 μL模板、0.5 μL Taq酶、13.5 μL H2O。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Silica Bead DNA Gel Extraction Kit回收、純化目的片段，連接pMD18-T載體，經驗證為陽性后送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.3 pGWB2植物表達載體的構建 植物表達載體構建采用Gateway技術，將PCR擴增得到的COMT1正義和反義片段回收純化后插入pENTR/SD/D-TOPO入門載體。經DNA測序正確的質粒與pGWB2采用Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix進行LR反應，反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，對陽性克隆進行鑒定篩選。

1.2.4 生物信息學分析 用DNASTAR軟件預測基因最長開放閱讀框及氨基酸序列，通過BLAST程序分析東北白樺與數據庫中已知物種的COMT1序列的同源性，用ClustalX軟件分析氨基酸序列一致性。

2 結果與分析

2.1 東北白樺COMT1完整編碼區(qū)cDNA序列的克隆

比對陸地棉、毛果楊、赤桉和歐洲白樺COMT基因同源序列的保守區(qū)后設計一對簡并引物（U1，U2），經PCR擴增得到東北白樺COMT1保守區(qū)核心DNA片段。進一步進行東北白樺COMT1的3′RACE擴增，獲得含3′端的東北白樺COMT1序列852 bp。經BLAST同源性比對表明，克隆得到的東北白樺COMT1基因序列與歐洲白樺COMT核酸相似度為99.5%。以報道的歐洲白樺COMT基因起始編碼區(qū)序列為上游引物，克隆得到的東北白樺COMT1基因終止編碼區(qū)為下游引物，PCR擴增得到長度約為1.1 kb的特異條帶（圖1），回收目的片段后測序，結果表明該序列長度為1 095 bp。加上該COMT1的3′端序列，克隆得到的東北白樺COMT1 cDNA序列全長為1 367 bp，將其上傳到GenBank數據庫中，登錄號為KC292201。

2.2 東北白樺COMT1完整編碼區(qū)cDNA序列分析

東北白樺COMT1開放讀碼框（Open reading frame）長度為1 095 bp（圖2），編碼365個氨基酸（圖3），同源性比對結果顯示東北白樺COMT1序列與陸地棉COMT（FJ479708）、毛果楊COMT（EU889124）、赤桉COMT（GU324973）以及歐洲白樺COMT（FJ667539.2）的同源性分別為79.2%、79.2%、77.2%和99.5%。

2.3 東北白樺COMT1植物表達載體的構建

用P1、P2引物擴增COMT1編碼區(qū)并將其與pENTR/SD/D-TOPO入門載體連接，得到重組質粒pENTR/SD/D-TOPO-COMT1，利用LR反應將該入門載體插入的COMT1片段交換到pGWB2植物過量表達載體上，得到pGWB2-COMT1植物過量表達載體。同理獲得COMT1反義植物表達載體pGWB2-antiCOMT1（圖4）。將構建的重組質粒導入農桿菌，獲得其工程菌分別用于今后白樺COMT1基因過量表達和降低表達的轉基因實驗。

3 小結與討論

白樺是東北地區(qū)重要的造林樹種，由于東北白樺木材材性脆、韌性和密度較弱，通過基因工程手段調控木質素代謝途徑是改良東北白樺材質與材性的有效途徑之一[12]。近幾年白樺基因工程相關研究零星地出現在一些報道中，如白樺果膠甲酯酶抑制劑（PMEI）可調節(jié)細胞壁的結構變化，實現對細胞生長的調控[13]；白樺苯丙氨酸解氨酶（PAL）對于其抵抗病原菌過程起著重要作用，并且其酶活力與抗病性正相關[14]；劉雪梅等[15]分離了白樺木質素生物合成相關酶CCoAOMT和4CL基因，并將其轉入煙草探討其調控煙草木質素合成的功能。COMT是S型木質素合成中的關鍵酶，并且與G型木質素向S型木質素的轉化密切相關。本研究克隆了東北白樺COMT1基因的全長編碼區(qū)序列，登錄在GenBank數據庫中，并構建了東北白樺COMT1的植物過量表達載體和反義表達載體，將其導入到農桿菌中。下一步工作將開展東北白樺木質素合成代謝的遺傳調控研究，為今后東北白樺材質與材性的改良奠定基礎。

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