白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε—聚賴氨酸工藝的優(yōu)化

摘要：采用白色鏈霉菌N31-69菌株發(fā)酵制備ε-聚賴氨酸，考察碳源、氮源等因素對(duì)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果表明，優(yōu)化的培養(yǎng)基為葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的濃度分別為30、7、7 g/L，ε-聚賴氨酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)1.519 g/L，比優(yōu)化前的產(chǎn)量提高了28.0%。進(jìn)一步對(duì)N31-69菌株在5 L發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵48 h后采用流加補(bǔ)糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，從72 h開始控制pH為4.3，發(fā)酵168 h后ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量可達(dá)15.60 g/L。

關(guān)鍵詞：白色鏈霉菌（Streptomyces albus）；ε-聚賴氨酸；培養(yǎng)基；發(fā)酵工藝

中圖分類號(hào)：TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3635-04

ε-聚賴氨酸由25～30個(gè)賴氨酸殘基聚合而成，有很強(qiáng)的抑菌能力[1]，被FDA批準(zhǔn)為安全的天然生物防腐劑，具有巨大的商業(yè)潛力[2]。日本窒素公司已實(shí)現(xiàn)ε-聚賴氨酸微生物發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)，發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)48.30 g/L[3，4]。而國內(nèi)ε-聚賴氨酸的研究還處于實(shí)驗(yàn)室水平，發(fā)酵產(chǎn)量與國外差距很大。劉長江等[5]優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量為1.50 g/L；陳瑋瑋等[6]對(duì)北里孢菌Kitasatospora MY5-36發(fā)酵產(chǎn)ε-聚賴氨酸的條件進(jìn)行優(yōu)化，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)1.17 g/L，在5 L發(fā)酵罐內(nèi)批式發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)7.72 g/L；黃國昌等[7]在50 L自控式發(fā)酵罐中對(duì)ε-聚賴氨酸的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)7.36 g/L。本研究采用白色鏈霉菌（Streptomyces albus）N31-16菌株發(fā)酵制備ε-聚賴氨酸，考察碳源、氮源、無機(jī)鹽等因素對(duì)發(fā)酵的影響，以提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量，為促進(jìn)ε-聚賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

白色鏈霉菌N31-16菌株，贛南醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選保藏[8]。

1.2 白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸流程

1.2.1 斜面培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基包括酵母浸出粉 4 g/L、麥芽浸出粉 10 g/L、葡萄糖 4 g/L，pH 7.3。接種環(huán)取一環(huán)平板上單菌落的孢子至斜面，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d。

1.2.2 搖瓶種子培養(yǎng) 搖瓶種子培養(yǎng)基為M3G[9]，含有葡萄糖50 g/L、（NH4）2SO4 10 g/L、K2HPO4 0.8 g/L、KH2PO4 1.36 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.04 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L、酵母浸出粉5 g/L，pH 6.8，裝液量為250 mL的三角瓶中裝20 mL培養(yǎng)基。接種環(huán)取一環(huán)斜面孢子，接入種子培養(yǎng)基，在30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min的條件下培養(yǎng)1 d。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基以M3G培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同的碳源、氮源和無機(jī)鹽，考察其對(duì)菌體生長和ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響，接種量為5%（占發(fā)酵液體積比，下同），其他培養(yǎng)條件同搖瓶種子培養(yǎng)。考察某一影響因素時(shí)保持其他培養(yǎng)基成分不變，以M3G培養(yǎng)基為對(duì)照，其ε-聚賴氨酸相對(duì)產(chǎn)量為100%，每處理設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的優(yōu)化 接種量3%，加入優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200～700 r/min，通氣速率2～5 m3/min。分別采用3種工藝進(jìn)行發(fā)酵，比較各種工藝對(duì)菌體生長和ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響。①工藝一：發(fā)酵液中還原糖濃度降至15 g/L以下后，每隔24 h間歇補(bǔ)糖至25 g/L，pH降至4.3后用氨水控制pH維持在4.3。②工藝二：還原糖濃度降至15 g/L以下后，用流加補(bǔ)糖方式控制發(fā)酵液中還原糖濃度為15～20 g/L，pH降至4.3后用氨水控制pH維持在4.3。③工藝三：還原糖濃度降至15 g/L以下后，采用流加補(bǔ)糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，72 h后用氨水控制pH維持在4.3。

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定 ①干重。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液于12 000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀洗滌3次，108 ℃下干燥至恒重后稱重。②菌體濃度（Packed Mass Volume， PMV）。取10 mL發(fā)酵液于4 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液體積。PMV=（發(fā)酵液總體積-上清液總體積）/發(fā)酵液總體積×100%。③殘?zhí)呛?。采用斐林試劑法測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)呛?。④?聚賴氨酸含量。采用優(yōu)化后的Itzhaki法[4]測(cè)定發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源對(duì)白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響 分別選用葡萄糖、土豆淀粉和玉米淀粉作為碳源，每種碳源各取3個(gè)水平，共9個(gè)處理。不同碳源對(duì)白色鏈霉菌菌體生長和ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見表1。由表1可知，3種碳源中，葡萄糖為碳源時(shí)發(fā)酵效果最好，有利于菌株的生長和ε-聚賴氨酸的積累，但過量的葡萄糖對(duì)ε-聚賴氨酸的生物合成有明顯的抑制作用，可能是由于葡萄糖效應(yīng)以及滲透壓過高引起的。當(dāng)葡萄糖濃度為30 g/L時(shí)ε-聚賴氨酸的相對(duì)產(chǎn)量最高，為118.9%。

2.1.2 氮源對(duì)白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響

1）單一氮源。分別選用（NH4）2SO4、尿素、大豆蛋白胨、酵母浸出粉為氮源，每種氮源各設(shè)置3個(gè)水平，共12個(gè)處理。不同氮源對(duì)白色鏈霉菌菌體生長和ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見表2。由表2可知，使用單一氮源，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量都很低，其中以（NH4）2SO4作為氮源，發(fā)酵液呈酸性，不利于菌體生長，菌體的生物量最低，但ε-聚賴氨酸的相對(duì)產(chǎn)量高于其他氮源；以尿素作氮源，發(fā)酵液呈堿性，菌體的生物量和ε-聚賴氨酸的相對(duì)產(chǎn)量均較低；而以大豆蛋白胨和酵母浸出粉作氮源，發(fā)酵液的pH呈弱酸性，有利于菌體生長，菌體生物量較高，但發(fā)酵產(chǎn)量很低，可能是發(fā)酵液pH偏高，導(dǎo)致ε-聚賴氨酸合成酶的活力低而降解酶的活力高，合成的ε-聚賴氨酸被降解酶分解[10]。因此考慮采用無機(jī)氮源（NH4）2SO4和有機(jī)氮源復(fù)合，同時(shí)促進(jìn)菌體生長和ε-聚賴氨酸的分泌。

2）復(fù)合氮源。無機(jī)氮源（NH4）2SO4分別與有機(jī)氮源大豆蛋白胨和酵母浸出粉組合作為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，（NH4）2SO4濃度設(shè)置2個(gè)水平，大豆蛋白胨和酵母浸出粉各設(shè)置3個(gè)水平，共12個(gè)氮源組合，每處理設(shè)置3次平行試驗(yàn)，考察其對(duì)白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，與（NH4）2SO4和大豆蛋白胨復(fù)合氮源相比，（NH4）2SO4和酵母浸出粉作復(fù)合氮源更有利于菌體的生長和ε-聚賴氨酸的積累。其中10 g/L （NH4）2SO4+10 g/L酵母浸出粉作氮源菌體生物量最大，達(dá)12.3%，5 g/L （NH4）2SO4+5 g/L酵母浸出粉最有利于ε-聚賴氨酸的積累，相對(duì)產(chǎn)量達(dá)119.5%，菌體的生長情況也較好，PMV達(dá)9.9%。

2.1.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)碳源和氮源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖作碳源，（NH4）2SO4和酵母浸出粉作復(fù)合氮源，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉濃度對(duì)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響，因素與水平見表4，結(jié)果見表5。由表5可知，培養(yǎng)基中（NH4）2SO4濃度對(duì)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響最大，其次是葡萄糖濃度，酵母浸出粉濃度的影響最小。最優(yōu)碳源和氮源組合為A2B2C3，即培養(yǎng)基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的濃度分別為30、7、7 g/L，此條件下ε-聚賴氨酸產(chǎn)量為1.519 g/L，高于其他正交試驗(yàn)組合的結(jié)果，比對(duì)照M3G培養(yǎng)基提高了28.0%。

2.2 5 L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的優(yōu)化

在5 L發(fā)酵罐內(nèi)研究N31-69菌株的發(fā)酵工藝，一方面放大搖瓶研究的成果，另一方面希望通過工藝的優(yōu)化進(jìn)一步提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。3種不同發(fā)酵工藝下菌體的生長和ε-聚賴氨酸的積累情況見表6～表8。由表6可知，工藝一發(fā)酵前72 h ε-聚賴氨酸基本無合成，當(dāng)降低pH后，ε-聚賴氨酸開始慢慢合成。72 h還原糖濃度降至15 g/L以下后，每隔24 h間歇補(bǔ)糖至25 g/L，96 h后菌體生物量開始下降，菌體趨于自溶，發(fā)酵168 h時(shí)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量為2.39 g/L。由表7可知，工藝二用流加補(bǔ)糖方式控制發(fā)酵液中還原糖濃度為15～20 g/L，72 h時(shí)降低pH后ε-聚賴氨酸迅速累積。120 h后菌體出現(xiàn)自溶，出現(xiàn)自溶時(shí)間更晚。發(fā)酵168 h 時(shí)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量為8.75 g/L。由表8可知，48 h后采用流加補(bǔ)糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，72 h后用10%的氨水控制pH在4.3，菌體生物量在發(fā)酵后期一直緩慢增加，未出現(xiàn)明顯的菌體自溶現(xiàn)象，發(fā)酵168 h時(shí)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量為15.60 g/L。

綜合以上3種發(fā)酵工藝，菌體的快速生長期為12～48 h，在此階段ε-聚賴氨酸基本不合成，降低pH后菌體生長變慢而ε-聚賴氨酸開始大量累積。還原糖濃度的補(bǔ)加方式及濃度對(duì)菌體的持續(xù)生長和ε-聚賴氨酸的累積有一定影響，采用流加補(bǔ)糖方式更佳，還原糖濃度控制在10～15 g/L最佳，可使菌體持續(xù)生長。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)發(fā)生較大變化（圖1）。在菌體生長期菌絲呈絮狀，到產(chǎn)物合成期菌絲開始結(jié)球，初期球的核心較松散，外周擴(kuò)散較大，后期ε-聚賴氨酸大量累積時(shí)所形成的菌球越來越致密，球徑變小，而當(dāng)菌體開始自溶時(shí)菌球消失，菌絲斷裂。菌絲形態(tài)變化可能和ε-聚賴氨酸的累積合成有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)與討論

本研究通過考察碳源、氮源、無機(jī)鹽等因素對(duì)白色鏈霉菌N31-69菌株生長和ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的影響，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的濃度分別為30、7、7 g/L， ε-聚賴氨酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)1.519 g/L，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了28.0%。進(jìn)一步在5 L發(fā)酵罐內(nèi)對(duì)N31-69菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，48 h后采用流加補(bǔ)糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，72 h后用10%的氨水控制pH為4.3，發(fā)酵168 h后ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量達(dá)15.60 g/L。在發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)發(fā)生較大變化，可能和ε-聚賴氨酸的累積合成有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] SHIMA S， SAKAI H. Poly-L-lysine produced by Streptomyces. Part Ⅲ. Chemical studies[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1981，45（11）：2503-2508.

[2] SHIH I L， SHEN M H， VAN Y T. Microbial synthesis of poly（ε-lysine） and its various applications[J]. Bioresource Technology，2006，97（9）：1148-1159.

[3] NISHIKAWA M， OGAWA K I. Distribution of microbes producing antimicrobial ε-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（7）：3575-3581.

[4] KAHAR P， IWATA T， HIRAKI J， et al. Enhancement of ε-polylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2001， 91（2）：190-194.

[5] 劉長江，于雪驪，楊玉紅，等.ε-聚賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].食品科技， 2007，32（11）：49-51.

[6] 陳瑋瑋，朱宏陽，徐 虹.ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株選育及分批發(fā)酵的研究[J].工業(yè)微生物， 2007，37（2）：28-30.

[7] 黃國昌，印培民，黃筱萍.50 L自控式發(fā)酵罐中ε-聚賴氨酸發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國食品添加劑， 2007（5）：99-103.

[8] 孫湘婷，王 力，王 巖.ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的誘變選育[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（3）：356-359.

[9] 孫湘婷，王 巖，陳少欣.甲基橙比色法測(cè)定發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量[J]. 分析試驗(yàn)室，2008，27（1）：302-304.

[10] KITO M， TAKIMOTO R， YOSHIDA T， et al. Purification and characterization of an ε-poly-L-lysine-degrading enzyme from an ε-poly-L-lysine-producing strain of Streptomyces albulus[J]. Archives of Microbiology，2002，178（5）：325-330.