TOLL樣受體在瘧疾感染小鼠模型中表達(dá)量變化規(guī)律的研究

摘要：為了深入了解瘧疾病理過(guò)程中TOLL樣受體（TLR）和炎癥反應(yīng)的關(guān)系，通過(guò)Real-time PCR、ELISA等方法，測(cè)定了小鼠感染伯氏瘧原蟲(chóng)后其TOLL樣受體（Toll like receptor，TLR）的mRNA水平和下游炎癥因子的血清水平。結(jié)果表明，TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平均顯著升高，分別為對(duì)照的3.0倍、3.5倍和6.0倍。說(shuō)明宿主通過(guò)TLR感知瘧原蟲(chóng)的侵入，并啟動(dòng)下游炎癥因子的過(guò)表達(dá)。

關(guān)鍵詞：TOLL樣受體；Real-time PCR；瘧疾；小鼠

中圖分類號(hào)：R382.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3589-04

瘧疾是一種以雌性按蚊為傳播媒介的傳染性疾病，主要流行在熱帶及亞熱帶地區(qū)。在全世界范圍內(nèi)，瘧疾每年造成至少150萬(wàn)人的死亡并為許多發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在中國(guó)北緯25°以南地區(qū)，仍有間日瘧和惡性瘧的流行。中緬及中越邊境時(shí)有惡性瘧原蟲(chóng)的輸入病例，并且每年都有因瘧疾感染而導(dǎo)致的死亡[2]。近年來(lái)，隨著氯喹等一線抗瘧藥物的普遍使用，抗藥性瘧原蟲(chóng)在非洲及東南亞地區(qū)日益普遍，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療成為治療瘧疾的首選[3]。但是，近年來(lái)在非洲已經(jīng)出現(xiàn)了青蒿素抗性瘧原蟲(chóng)，在亞洲的泰國(guó)等地甚至出現(xiàn)了青蒿素和氯喹雙重抗性的瘧原蟲(chóng)[3]。人類在青蒿素之后已經(jīng)沒(méi)有任何新的治療藥物或者手段來(lái)對(duì)抗瘧疾了。所以開(kāi)發(fā)新的抗瘧藥物或治療方法已成為對(duì)抗瘧疾的迫切任務(wù)。TOLL樣受體（Toll-like receptor，TLR）是由Lemaitre等[4]于1996年首次發(fā)現(xiàn)。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)TOLL樣受體是機(jī)體天然免疫中非常重要的組成部分，在入侵病原突破了機(jī)體的機(jī)械屏障（如皮膚、黏膜等）后感知入侵病原并隨后啟動(dòng)下游的炎癥反應(yīng)。研究表明，TOLL樣受體可以感知細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)等病原微生物的入侵[5]。2005年，Science雜志報(bào)道，小鼠的TLR-11可識(shí)別弓形蟲(chóng)的肌動(dòng)蛋白抑制蛋白樣蛋白[6]。而在瘧疾感染的進(jìn)程中，TOLL樣受體如何發(fā)揮作用尚無(wú)明確報(bào)道。本研究通過(guò)Real-time PCR等方法驗(yàn)證TOLL樣受體在瘧疾感染小鼠模型的病理進(jìn)程中其表達(dá)量的變化，以探討TOLL樣受體在這一過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡昆明鼠90只，雌雄各半，體重18～22 g，購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。原生動(dòng)物門(mén)伯氏瘧原蟲(chóng)（Plasmodium berghei），購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室。

1.1.2 感染小鼠 初次感染時(shí)，取10只小鼠，然后從液氮中取出凍存的伯氏瘧原蟲(chóng)（其存在于購(gòu)得的感染伯氏瘧原蟲(chóng)的小鼠外周血中），37 ℃解凍復(fù)蘇，將血液給每只小鼠腹腔注射0.3 mL。待小鼠外周血被蟲(chóng)體感染的紅細(xì)胞超過(guò)30%后，摘除小鼠眼球取血，并加肝素抗凝。2 500 r/min離心20 min，棄上清液，加入滅菌生理鹽水，重新懸浮紅細(xì)胞，并重復(fù)上述步驟，如此反復(fù)洗3次后，加入滅菌生理鹽水并懸浮紅細(xì)胞，用于再次感染試驗(yàn)用小鼠。

1.2 肝臟的提取及保存

將感染小鼠麻醉后從眼球或心臟放血，放血后將其斷頸，打開(kāi)其腹腔，取出肝臟用液氮速凍并在液氮中保存。

1.3 血清的提取及保存

將小鼠麻醉后，打開(kāi)小鼠胸腔，用無(wú)菌注射器從小鼠心臟直接抽取心臟血液后加入到滅菌EP管中，37 ℃ 2 h，2 500 r/min離心20 min，取上清液，液氮保存。

1.4 總RNA的提取

1.4.1 小鼠處理方法 取40只小鼠隨機(jī)平均分為2組，即感染組和對(duì)照組，在感染組小鼠經(jīng)腹腔注射感染伯氏瘧原蟲(chóng)后，于1、24、96、144 h分別在2組各取5只小鼠麻醉，取心臟血后將其斷頸取其肝臟。取出的血液加入到滅菌EP管中，37 ℃ 2 h，

2 500 r/min離心20 min，取上清液，液氮保存；肝臟用液氮速凍并在液氮中保存。

1.4.2 操作步驟 將試驗(yàn)要使用的槍頭、EP管等用DEPC水浸泡至少14 h并高壓滅菌，研缽180 ℃干熱滅菌4 h。取小鼠肝臟（不超過(guò)20 mg）在液氮中研磨成細(xì)粉狀，加入到裂解液中充分渦旋振蕩，之后的步驟按天根試劑公司的動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取完成之后再在液氮中凍存。

1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR過(guò)程

1.5.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1）在微量離心管中加入總RNA 1 μL，Oligo dT 1 μL，輕輕混勻。

2）70 ℃加熱5 min，立即將微量離心管插到冰上；然后再加入5×M-MLV Buffer（含dTT） 4 μL，dNTP 1 μL，最后補(bǔ)充適量的DEPC水使總體積達(dá)到19.5 μL，輕輕混勻。

3）加入反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 0.5 μL；重新置于PCR儀中，42 ℃ 1 h，94 ℃ 5 min，完成反轉(zhuǎn)，將反轉(zhuǎn)產(chǎn)物迅速插冰上，最后放置于-20 ℃保存。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

1）引物序列：針對(duì)不同的目的片段TLR-2、TLR-9和TLR-11，引物分別為：

TLR-2引物：上游引物TLR2A 5′-TGGAATGTCACCAGGCTGC-3′，下游引物TLR2B 5′-GTCCGTGGAAATGGTGGC-3′；

TLR-9引物：上游引物TLR9A 5′-TTCTCAAGACGGTGGATCGC-3′，下游引物TLR9B 5′-GCAGAGGGTTGCTTCTCACG-3′；

TLR-11引物：上游引物TLR11A 5′-TCTTTG- ACGCTCGGAACTGTAGCA-3′，下游引物TLR11B 5′-TAGGTCGATGCACAACTGGGTGAA-3′。

以上3對(duì)引物的最佳退火溫度分別為57.5、59.0、59.0 ℃。

2）PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系50 μL，即無(wú)菌水38 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。

3）PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，57.5 ℃或59.0 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。并對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物電泳分析看其是否與擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度吻合。

1.6 連接pMD18-T

將切膠回收的PCR產(chǎn)物4 μL與T Vector 1 μL 65 ℃處理5 min，迅速插到冰上，加入5 μL solution I，16 ℃過(guò)夜連接。

1.7 轉(zhuǎn)化DH5α

將連接產(chǎn)物10 μL加入到50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，隨后42 ℃熱激90 s，迅速插冰上3 min，加入500 μL不含抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，3 000 r/min離心4 min，吸取上清液500 μL，棄去，剩下的液體用槍頭吹勻，并涂布在氨芐抗性的固體LB平板上。

1.8 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

1.8.1 PCR擴(kuò)增

1）PCR測(cè)序引物設(shè)計(jì)：模板使用已連接目的基因的T載體。引物使用PCR引物，與上述1.5.2中的引物相同。

2）PCR測(cè)序反應(yīng)體系 ：50 μL反應(yīng)體系中加入無(wú)菌水38 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。

3）PCR測(cè)序反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，57 ℃退火 1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，每次PCR反應(yīng)均嚴(yán)格設(shè)立陰性對(duì)照。

1.8.2 PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切下擴(kuò)增片段，用上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收純化試劑盒純化后直接用于測(cè)序。控制區(qū)的測(cè)序引物直接使用PCR引物。測(cè)序反應(yīng)使用Perkin-Elmer（PE） BigDyeTM Terminator Cycle Sequence Kit進(jìn)行反應(yīng)。在96孔PCR板的每一孔中將反應(yīng)物Kit 2 μL，引物（10 pmol/ μL）1 μL，DNA模板 1～4 μL混合。反應(yīng)條件根據(jù)PE公司建議條件：96 ℃ 10 s，50 ℃ 15 s，25個(gè)循環(huán)；60 ℃ 4 min。測(cè)序反應(yīng)完成后，進(jìn)行測(cè)序純化。其步驟如下：

1）將取下的96孔板帶膜瞬時(shí)離心。撕下蓋膜，每孔加入4倍體積的75%異丙醇，振蕩混勻后，靜置30 min。4 000 r/min離心30 min。將96孔板倒置在吸水紙上，800 r/min離心1 min。

2）加入8倍體積的75%異丙醇，蓋好膜后在振蕩器上混勻，靜置2 min，4 000 r/min離心10 min。將96孔板倒置在另一干凈的吸水紙上，900 r/min離心1 min。

3）室溫?fù)]發(fā)殘余異丙醇約10 min，加入30 μL滅菌去離子水，振蕩1～2 min，500 r/min瞬時(shí)離心1 min，將96孔板上樣到測(cè)序儀上。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后在ABI3730全自動(dòng)測(cè)序儀上讀取序列。測(cè)序結(jié)果顯示所克隆序列與目的序列完全符合。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR分析

總RNA提取產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)總RNA質(zhì)量，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，作為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的模板，內(nèi)參照選用小鼠的β-actin基因。再用Takara公司的SYBR？誖 Premix Ex TaqTM試劑盒在ABI Prism 7500 Sequence Detection System上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)完畢后使用ABI Prism 7500 Sequence Detection System自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.10 ELISA分析

以小鼠血清為材料，稀釋20倍后作為模板進(jìn)行ELISA反應(yīng)，操作程序以RD公司說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)，反應(yīng)完畢后在BIO-RAD 680酶標(biāo)儀上讀數(shù)，并按要求繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)指標(biāo)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLR-2、TLR-9、TLR-11表達(dá)量變化情況

小鼠經(jīng)腹腔注射伯氏瘧原蟲(chóng)之后，其紅細(xì)胞的感染率在1、24、96和144 h分別為0、6.0%、42.7%和38.2%（圖1）。對(duì)TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，上述3個(gè)基因的表達(dá)量均有顯著升高，其中TLR-2和TLR-9的表達(dá)量在96 h時(shí)分別為對(duì)照組的3.0倍和3.5倍（圖2、圖3），TLR-11的表達(dá)量升高達(dá)對(duì)照組的6.0倍（圖4），與對(duì)照組之間差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）。

2.2 瘧疾炎癥反應(yīng)過(guò)程中主要炎癥反應(yīng)因子的變化情況

將小鼠的血清用滅菌生理鹽水稀釋20倍后作為模板對(duì)瘧疾炎癥反應(yīng)過(guò)程中的主要炎癥因子用ELISA方法進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，相比TOLL樣受體的變化量，各下游炎癥反應(yīng)因子的變化更為劇烈，可以推斷，TOLL樣受體在感知了入侵病原伯氏瘧原蟲(chóng)之后啟動(dòng)了一系列的下游反應(yīng)，這些下游反應(yīng)呈逐級(jí)放大的趨勢(shì)，在反應(yīng)到達(dá)終端的炎癥因子（如IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18等）時(shí)，這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)的效果相當(dāng)驚人。

ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-6 在1 h時(shí)為36 U/mL，96 h峰值時(shí)升高至10 023 U/mL（圖5）；TNF-α在96 h峰值時(shí)升高至485 pg/mL（圖6），而其基線水平只有20 pg/mL；IL-12在96 h時(shí)達(dá)到峰值，為186 pg/mL（圖7）；IL-18在96 h時(shí)其血清水平為3 045 pg/mL（圖8）。當(dāng)TOLL樣受體水平和感染率在貧血癥狀趨于明顯開(kāi)始下降時(shí)，這些炎癥因子水平也迅速下降，下降的因素包括TOLL樣受體水平的降低，也包括在瘧疾感染后期各個(gè)機(jī)體的正常生理機(jī)能遭到嚴(yán)重破壞而導(dǎo)致的下降。值得注意的是，在測(cè)定的所有炎癥因子中，只有IL-18血清水平?jīng)]有隨著感染率和TOLL樣受體水平的下降而下降，在96 h之后仍然持續(xù)升高，其中的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

3 小結(jié)與討論

本研究重點(diǎn)討論了TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平在伯氏瘧原蟲(chóng)侵染小鼠模型過(guò)程中表達(dá)量變化的規(guī)律。其中，TLR-2可以感知瘧原蟲(chóng)的磷脂酰肌醇，TLR-9則感知入侵微生物的DNA[7，8]，近期研究也顯示人工合成的瘧色素通過(guò)尾靜脈注射給小鼠后，也可通過(guò)TLR-9途徑啟動(dòng)下游的炎癥反應(yīng)[9]。雖然這一觀點(diǎn)尚有爭(zhēng)議，一些學(xué)者認(rèn)為瘧色素本身沒(méi)有免疫原性，必須在瘧色素表面附著瘧原蟲(chóng)的DNA才能有效地啟動(dòng)TLR-9途徑[10]。TLR-11在2005年首次報(bào)道可以在小鼠體內(nèi)特異性識(shí)別弓形蟲(chóng)的肌動(dòng)蛋白抑制蛋白樣蛋白[6]。而肌動(dòng)蛋白抑制蛋白在進(jìn)化上非常保守，從低等生物到高等生物其氨基酸序列的變化非常小。弓形蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)同屬孢子蟲(chóng)綱生物，所以需要驗(yàn)證在瘧原蟲(chóng)侵染過(guò)程中TLR-11是否也發(fā)揮了一定的作用。我們通過(guò)Real-time PCR方法驗(yàn)證了在這一過(guò)程中上述3種TOLL樣受體表達(dá)量變化規(guī)律。結(jié)果顯示，TLR-11的mRNA水平在感染后96 h升高至對(duì)照的6.0倍。TLR-2和TLR-9也相應(yīng)升高至對(duì)照的3.0倍和3.5倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在TOLL樣受體的mRNA水平升高之后其下游的各種炎癥因子劇烈升高。這些炎癥因子包括IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18等。其中IL-12在瘧疾的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，IL-12在TLR-11感知瘧原蟲(chóng)的肌動(dòng)蛋白抑制蛋白之后其在肝臟中的水平迅速升高，從感染瘧疾的肝臟中分離出的B細(xì)胞甚至具有殺傷正常B細(xì)胞的能力[6]。在瘧疾的病理進(jìn)程中，炎癥反應(yīng)是一把雙刃劍，在感染的初期，這些炎癥因子可以有效地抑制瘧原蟲(chóng)的繁殖，同時(shí)炎癥也是造成瘧疾死亡病例的重要因素，包括由于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的血腦屏障通透性改變而產(chǎn)生的腦瘧以及后期產(chǎn)生的瘧疾性貧血等。

對(duì)瘧疾病理進(jìn)程中炎癥反應(yīng)細(xì)節(jié)的深入了解有助于我們尋找新的藥物靶點(diǎn)或新的治療手段。例如TOLL樣受體的抗體或拮抗劑是否有助于在瘧疾侵染時(shí)適當(dāng)降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)水平，降低炎癥反應(yīng)對(duì)宿主自身的傷害，從而降低瘧疾感染的死亡率等。

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