草莓新品種晶玉高效離體再生體系的建立

摘要：以草莓新品種晶玉為試材，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和配比對(duì)其葉片、葉柄再生的影響及不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉片再生的影響，并篩選出了最佳的生根培養(yǎng)基，建立了晶玉的高效離體再生體系。結(jié)果表明，培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D對(duì)晶玉葉片不定芽的分化效果最好，平均不定芽再生率可達(dá)81.45%，每葉塊平均再生芽數(shù)達(dá)到4.47個(gè)；暗培養(yǎng)7 d有利于葉片不定芽的再生。培養(yǎng)基MS+3.0 mg/L TDZ +0.05 mg/L 2，4-D對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的效果最好。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：草莓；晶玉；離體再生；葉片；葉柄

中圖分類號(hào)：S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5912-05

晶玉是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所以甜查理為母本，晶瑤為父本雜交選育的草莓新品種，于2012年通過(guò)湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)的審定[1]。該品種具有品質(zhì)較優(yōu)、抗炭疽病和白粉病、豐產(chǎn)性好等優(yōu)勢(shì)，是生產(chǎn)上很有潛力的一個(gè)栽培品種。建立其高效的再生體系，對(duì)于草莓品種的種質(zhì)交換及進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義[2，3]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)草莓的組織培養(yǎng)再生研究已有一些報(bào)道，主要集中在對(duì)草莓莖尖快速繁殖，不同品種的葉片、葉柄、花藥不定芽再生等方面[4-6]。在草莓再生的相關(guān)研究中涉及的品種主要是豐香、晶瑤、Tudla、全明星、紅顏等[7-12]，但具有高效再生體系的優(yōu)良草莓品種仍然較少，有必要進(jìn)一步對(duì)新審定的草莓品種進(jìn)行高效再生體系研究。本研究以晶玉葉片、葉柄為試材，研究了不同激素濃度和配比對(duì)葉片、葉柄不定芽分化的影響，暗處理對(duì)不定芽分化的影響等，建立了草莓新品種晶玉的高效離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為草莓新品種晶玉，2011年4月種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所草莓試驗(yàn)圃，6月在田間選取健壯草莓母株上，生長(zhǎng)充實(shí)而小葉尚未展開的匍匐莖頂端約3～4 cm長(zhǎng)的頂芽。

1.2 無(wú)菌材料的獲得

將匍匐莖頂芽用自來(lái)水沖洗干凈并擦干，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，按下列程序消毒。70%酒精浸潤(rùn)30 s，無(wú)菌水沖洗1次，然后用0.1% HgCl2消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次。將處理好的頂芽在無(wú)菌紙上逐層剝?nèi)ビ兹~取出莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，接于MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d（下同）。莖尖在MS培養(yǎng)基上成活后，在MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次，以25 d苗齡無(wú)菌試管苗的葉片、葉柄為試驗(yàn)材料。

1.3 不同濃度6-BA與IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

取長(zhǎng)勢(shì)健壯、三出復(fù)葉均展開的晶玉無(wú)菌試管苗葉片，去除葉片邊緣部分，切成5 mm×5 mm左右的小塊狀葉盤，以近軸面向下與再生培養(yǎng)基接觸進(jìn)行培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS+30 g/L 蔗糖（Sucrose）+ 2.5 g/L 菲特膠（Phytagel）為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的6-BA與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IAA激素配比，50 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，研究不同濃度的6-BA與IAA組合對(duì)晶玉草莓葉片不定芽再生的影響。每個(gè)處理80片葉，每處理3次重復(fù)。接種后培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃、光照度 1 500～2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d（除暗培養(yǎng)外，下同）。

1.4 不同濃度TDZ與2，4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

同“1.3”的接種培養(yǎng)方法，以MS+ 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的噻苯?。═DZ，Thidiazuron）與0.05、0.10、0.20 mg/L 的2，4-D激素配比，50 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，研究不同濃度的TDZ與2，4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響。

1.5 不同濃度TDZ與IBA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

同“1.3”的接種培養(yǎng)方法，以MS+30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基， pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的TDZ與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IBA激素配比，50 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，研究不同濃度的TDZ與IBA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響。

1.6 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

以MS + 2.0 mg/L TDZ + 0.05 mg/L 2，4-D + 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為培養(yǎng)基，pH 5.8，葉盤接種后在（25±2） ℃條件下，分別進(jìn)行0、7、14、21、28 d的暗處理，在光照度1 500～2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d的條件下培養(yǎng)，研究不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響。每個(gè)處理80片葉，每處理3次重復(fù)。

1.7 不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響

取長(zhǎng)勢(shì)健壯、三出復(fù)葉均展開的晶玉無(wú)菌試管苗葉柄，切成1 cm左右的小段與再生培養(yǎng)基接觸進(jìn)行培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS+30 g/L Sucrose+2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別添加不同濃度的TDZ與2，4-D或IBA的配比，50 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，研究不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響。每個(gè)處理80個(gè)葉柄切段，每處理3次重復(fù)。接種后培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d。

1.8 晶玉的再生小苗生長(zhǎng)與植株生根

將再生的晶玉不定芽在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA上繼代培養(yǎng)1次，當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)，將生長(zhǎng)健壯的無(wú)根小苗接種于不同生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。通過(guò)生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)、平均根粗等指標(biāo)綜合衡量晶玉的最佳生根培養(yǎng)基。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在不定芽再生過(guò)程中，持續(xù)觀察外植體形態(tài)變化及不定芽再生情況。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計(jì)不同處理不定芽再生頻率和每個(gè)外植體再生的不定芽個(gè)數(shù)，計(jì)算不定芽再生率及每個(gè)外植體再生芽數(shù)。

不定芽再生頻率=再生出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%

每個(gè)外植體再生芽數(shù)=外植體再生出的不定芽總數(shù)/再生出不定芽的外植體數(shù)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用SAS 8.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA與IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

晶玉葉盤接種于添加了6-BA與IAA不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上，愈傷產(chǎn)生量少，且愈傷多為淺綠色、質(zhì)地較致密堅(jiān)硬，30 d左右不定芽開始分化。大部分不定芽經(jīng)愈傷組織分化形成，少量不定芽直接在葉片切口末端形成。如表1所示，不同濃度的6-BA與IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的試驗(yàn)中，該組合總體上能夠誘導(dǎo)葉片不定芽的再生，但再生頻率較低。其中2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生相對(duì)較好，再生率達(dá)到19.05%，與其他處理間差異顯著。

2.2 不同濃度TDZ與2，4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

從表2可以看出，在同一TDZ水平上，晶玉葉片不定芽再生率隨著2，4-D濃度的升高呈顯著下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明培養(yǎng)基中附加低濃度（小于0.10 mg/L）的2，4-D有利于晶玉葉片不定芽的再生。葉片接種于添加了TDZ與2，4-D不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上，產(chǎn)生愈傷多為黃綠色顆粒狀，質(zhì)地較致密，25 d左右開始形成不定芽。結(jié)果表明，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生最好，再生率達(dá)到81.45%，顯著高于其他處理，平均再生芽數(shù)達(dá)到4.47個(gè)。3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合不定芽再生率也較高，但觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TDZ濃度較高時(shí)（大于2.0 mg/L），再生出的不定芽玻璃化嚴(yán)重，因此TDZ濃度不宜過(guò)高，以2.0 mg/L為宜。如圖1所示，圖1a為晶玉葉片接種7 d后在切口邊緣形成明顯的黃綠色愈傷，圖1b為晶玉葉片愈傷再生出的不定芽。

2.3 不同濃度TDZ與IBA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

在TDZ與IBA不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上，晶玉葉片多產(chǎn)生黃綠色顆粒狀愈傷、少量為塊狀，質(zhì)地致密，30 d左右開始形成不定芽。從表3可以看出，2.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA組合對(duì)培養(yǎng)晶玉葉片不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率達(dá)到55.96%，顯著高于其他處理，每葉塊平均再生芽數(shù)達(dá)到3.55個(gè)；當(dāng)TDZ濃度進(jìn)一步提高到3.0 mg/L時(shí)，不定芽再生率開始下降，且不定芽以叢生狀為主，長(zhǎng)勢(shì)較弱，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。

2.4 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響

不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響如表4所示。暗培養(yǎng)7 d平均不定芽再生率最高，達(dá)到84.53%，每個(gè)外植體再生芽數(shù)達(dá)到5.01個(gè)，顯著高于沒有暗培養(yǎng)的處理，表明暗培養(yǎng)對(duì)晶玉葉片不定芽的再生有一定促進(jìn)作用。觀察發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行7 d暗培養(yǎng)，可以減輕晶玉葉片切口的褐化現(xiàn)象，這可能是暗培養(yǎng)促進(jìn)不定芽再生的主要原因。但暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于不定芽的分化再生。

2.5 不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響

不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響結(jié)果如表5所示。在13種激素組合中，3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對(duì)晶玉葉柄不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率達(dá)到57.83%，顯著高于其他處理，每葉塊平均再生芽數(shù)達(dá)到3.59個(gè)。晶玉葉柄不定芽再生如圖1所示，其中圖1c為晶玉葉柄接種7 d后在切段兩端形成明顯的黃綠色塊狀愈傷，圖1d為葉柄愈傷再生不定芽。

2.6 不同生根培養(yǎng)基對(duì)晶玉植株生根的影響

再生出來(lái)的晶玉不定芽在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)1次后生長(zhǎng)成小植株，如圖1e所示。在如表6所示的7種生根培養(yǎng)基中，從各項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮，晶玉的最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA，其生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)、平均根粗分別達(dá)到了99.33%、11.67個(gè)、3.04 cm、0.80 mm。晶玉不定芽生根形成的完成植株如圖1f所示。

3 小結(jié)與討論

影響草莓再生的因素較多，其中草莓品種自身特性、培養(yǎng)基、不同激素的種類和濃度配比等是關(guān)鍵因子。近幾年，湖北省草莓育苗期炭疽病病害發(fā)生嚴(yán)重[13]，而晶玉是一個(gè)對(duì)炭疽病具有較高抗性的品種，其在生產(chǎn)上應(yīng)用潛力較大。晶玉高效的再生體系對(duì)于種質(zhì)交換及進(jìn)一步的草莓遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。

激素種類和配比是影響外植體器官發(fā)生的重要因素。在離體培養(yǎng)中一般生長(zhǎng)素有利于根的形成，而細(xì)胞分裂素有利于芽的形成，通過(guò)改變二者的比例可以調(diào)節(jié)芽的形成。在不同類型的激素組合中，以TDZ與2，4-D配合使用時(shí)晶玉再生頻率較高，這可能與TDZ強(qiáng)烈的細(xì)胞分裂素活性有關(guān)。本試驗(yàn)建立了晶玉的高效離體再生體系，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的效果最好，再生率達(dá)到81.45%；3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的效果最好，再生率達(dá)到57.83%。

暗培養(yǎng)也是影響草莓葉片再生率高低的重要因素之一。有相關(guān)報(bào)道指出[9，14，15]，草莓不同品種再生所需要的合適的暗培養(yǎng)時(shí)間各有不同，草莓豐香的最佳暗培養(yǎng)時(shí)間是14 d，草莓吐德拉是21 d，草莓幸香是42 d。本研究結(jié)果表明，晶玉葉片再生最佳的暗培養(yǎng)時(shí)間是7 d。暗培養(yǎng)的主要作用是讓外植體在再生過(guò)程中減少溢出酚類物質(zhì)，減輕褐化，維持植物材料較好的生理狀態(tài)[16，17]，因而有利于再生。

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