地高辛標(biāo)記DNA探針對茶園NPV的檢測

摘要：研究合成了茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）的地高辛標(biāo)記DNA探針，采用斑點雜交檢測茶園幾種核型多角體病毒。結(jié)果表明，以含EcobNPV克隆片段的大腸桿菌菌液為樣品時，斑點雜交檢測靈敏度為80 CFU/μL。以感染病毒致死的茶尺蠖幼蟲為試材，提取病毒基因組DNA，采用斑點雜交法檢測均得到強(qiáng)的雜交信號。斑點雜交檢測可有效區(qū)分茶園中幾種核型多角體病毒，表明地高辛標(biāo)記DNA探針的特異性好。

關(guān)鍵詞：茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）；地高辛標(biāo)記DNA探針；斑點雜交；檢測

中圖分類號：Q93-331；S476+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5894-04

茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）屬鱗翅目尺蠖蛾科害蟲，我國各茶區(qū)均有發(fā)生。以幼蟲食葉為害，嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量，且易導(dǎo)致茶樹早衰、耐寒力變差[1]。茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis oblique

nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）于1977年在我國首次發(fā)現(xiàn)[2]，屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。EcobNPV是茶尺蠖的重要致病微生物，它通過幼蟲取食后侵入蟲體并迅速增殖，使其感染發(fā)病而死亡，并且對茶尺蠖幼蟲感染力強(qiáng)，致死率高，對人、畜及天敵昆蟲安全[3-7]，尤其是其可通過感病幼蟲的排泄物或尸體等進(jìn)行水平擴(kuò)散，通過產(chǎn)卵進(jìn)行垂直傳遞[8]，對茶尺蠖危害具有良好的持續(xù)控制效果。我國較早開展了EcobNPV的生物學(xué)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究，現(xiàn)在該病毒制劑已獲批農(nóng)藥登記許可，廣泛應(yīng)用于各種類型茶園。

目前，EcobNPV主要使用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行定性檢測，該方法存在操作過程易污染、單次檢測樣本少且假陽性高等缺點，而核酸斑點雜交技術(shù)因具有靈敏度高、結(jié)果觀察直觀和在單位膜上可完成多個樣品的同時檢測等優(yōu)點，尤其是非放射性標(biāo)記的發(fā)展，使該技術(shù)在病毒和類病毒的研究和檢測中得到廣泛應(yīng)用[9]。同時核酸斑點雜交技術(shù)還可反映病毒株間在基因水平上親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近或異同。

為監(jiān)測茶尺蠖核型多角體病毒在茶園的流行動態(tài)，并比較其與某些昆蟲桿狀病毒的同源性，本研究以EcobNPV為試驗材料，探索了該病毒的核酸斑點雜交檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

EcobNPV湖北分離株由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所茶植保課題組提供。EcobNPV安徽分離株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供。茶毛蟲、茶刺蛾、茶小卷葉蛾、感染EcobNPV的茶尺蠖均為2011年在本所茶園收集。

1.2 試驗試劑

dNTP購自Promega公司；Taq DNA聚合酶購自Takara公司；帶正電的尼龍膜為Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；探針標(biāo)記試劑盒和雜交檢測試劑盒為New England Biolabs公司產(chǎn)品。

1.3 核酸雜交

1.3.1 病毒提純 采用常規(guī)方法[10，11]進(jìn)行病毒提純。在供試的茶毛蟲、茶刺蛾、茶小卷葉蛾、感染EcobNPV的茶尺蠖中加入PBS 緩沖液充分研磨后，4層紗布過濾，濾液4 ℃條件下500 r/min 離心5 min棄沉淀，上清液3 500 r/min離心30 min。用適量緩沖液繼續(xù)懸浮沉淀，3 500 r/min 離心30 min。差速離心反復(fù)進(jìn)行多次，直至多角體懸液呈乳白色狀。

1.3.2 基因組DNA的提取 取適量純化的多角體懸液加入等體積的新配制的堿裂解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaCl），37 ℃水浴30～60 min；加100 mg/mL SDS至終濃度為10 mg/mL，加蛋白酶K至終濃度為200 μg/mL，37 ℃水浴1 h；加入等體積水飽和酚∶氯仿（體積比25∶24），振蕩混勻，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min；取上清液加入等體積的氯仿，振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，重復(fù)此步驟1次；取上清液加入0.1倍體積的3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.4）和2.5倍體積無水乙醇，-20 ℃沉淀20 min 后12 000 r/min離心15 min，棄上清液，用70%乙醇洗滌2次，于超凈臺上吹干，用適量水或TE溶解，4 ℃保存?zhèn)溆肹12-14]。

1.3.3 目的片段PCR擴(kuò)增 根據(jù)EcobNPV基因組序列（NC_008586.1）設(shè)計了1對特異性引物，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為10F：5′-ATGATACTCGTTACAGTTACAACCC-3′和10R：5′-TTAATACGCAGGTCCTGAATAC-3′。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：模板DNA 1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，正反引物各0.5 μL，Tag酶0.25 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。最后，用瓊脂糖凝膠DNA試劑盒純化回收擴(kuò)增片段，測定濃度。

1.3.4 探針標(biāo)記 將回收的PCR片段合成探針，按試劑盒（DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I）標(biāo)明的方法，在Klenow大片段介導(dǎo)下合成地高辛標(biāo)記的DNA探針，標(biāo)記探針置于-20 ℃保存。

1.3.5 Dot-blot雜交 取基因組DNA，在經(jīng)2×SSC浸泡5 min后晾干的帶正電荷的尼龍膜上點樣，每樣約1.0 μL，室溫下晾干。加樣后的尼龍膜用蛋白酶K（100 μg/mL）在37 ℃處理30 min，2×SSC洗滌2次后用變性液（0.5 mol/L NaOH+1.5 mol/L NaCl）65 ℃孵育30 min，再用中和液（0.5 mol/L Tris-HCl+1.5 mol/L NaOH，pH 7.5）室溫下洗5 min，10×SSC洗滌1次，置于UVC500 UV型紫外交聯(lián)儀中固定3 min。將膜置于雜交管中（預(yù)雜交液1 mL/cm2）68 ℃預(yù)雜交6 h。取地高辛標(biāo)記的核酸探針煮沸5 min，冰上迅速冷卻5 min，加入到預(yù)雜交液中，68 ℃雜交12 h。雜交結(jié)束后，將膜取出，用含0.1%SDS的2×SSC室溫下洗滌5 min，重復(fù)1次，然后用含0.1%SDS的0.5×SSC于68 ℃洗膜15 min，重復(fù)1次，最后進(jìn)行雜交結(jié)果的檢測。

1.3.6 結(jié)果檢測 按0.1 mL/cm2的量將膜放入洗液中，室溫下適當(dāng)振蕩5 min，排干洗液。加入100 mL封閉液室溫孵育30 min，然后加入20 mL 抗體溶液室溫孵育30 min，再去除溶液。按1 cm2膜0.5 mL的量加入洗液，室溫洗膜15 min，輕微搖動，去除溶液，重復(fù)1次。加20 mL檢測溶液平衡2～5 min，排干封閉液，加入20 mL底物顯色液，置于黑暗處顯色，最后加入雙蒸水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA電泳結(jié)果

收集在室內(nèi)感染病毒致死的茶尺蠖幼蟲蟲尸，研磨后差速離心，采用常規(guī)方法提取病毒基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳后顯示的條帶明亮、清晰，表明提取的茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA結(jié)果理想（圖1）。

2.2 目的片段擴(kuò)增結(jié)果

取PCR產(chǎn)物2 μL于1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果在約700 bp處有DNA片段，與預(yù)計大小一致（圖2）。將該擴(kuò)增片段回收連接到載體pMD18-T上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中得到重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，片段大小為700 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。進(jìn)一步測序分析也與預(yù)期序列相符。

將PCR產(chǎn)物回收，取1 μL稀釋100倍使用分光光度計測定DNA濃度為137 ng/μL，且OD260 nm/ OD280 nm接近2，表明核酸較純，可直接用于探針標(biāo)記。

2.3 地高辛標(biāo)記探針的效價及靈敏度檢測

標(biāo)記探針用0.1 mol/L NaOH以10倍梯度進(jìn)行稀釋，然后取1 μL稀釋溶液在雜交膜上點樣，采用檢測試劑盒進(jìn)行檢測，根據(jù)催化底物發(fā)光后在X膠片上產(chǎn)生的信號強(qiáng)度，以試劑盒中提供的地高辛標(biāo)記物作參照，判斷所標(biāo)記探針的活性。結(jié)果表明，當(dāng)探針稀釋至1×106時仍產(chǎn)生可見雜交信號，表明所得標(biāo)記探針具有較強(qiáng)的活性。當(dāng)用NBT/BCIP為底物通過化學(xué)顯色判斷結(jié)果時，其靈敏度較化學(xué)發(fā)光檢測法低1個數(shù)量級。

以含病毒基因片段的大腸桿菌（Escherichia coli）陽性克隆菌液為樣品，經(jīng)倍比稀釋后取2 μL在雜交膜上點樣，以測定斑點雜交檢測的靈敏度。結(jié)果顯示，當(dāng)EcobNPV陽性克隆菌液稀釋至1 280倍時，仍可產(chǎn)生可見的雜交信號（圖4），其檢測靈敏度相當(dāng)于80 CFU/μL。

2.4 斑點雜交檢測茶園幾種核型多角體病毒的特異性

經(jīng)病毒飼養(yǎng)的茶尺蠖幼蟲蟲尸在緩沖液中研磨后差速離心，提取基因組DNA，在雜交膜上點樣，每樣約1.0 μL，以相同處理健康茶尺蠖幼蟲基因組DNA為陰性對照。雜交檢測結(jié)果表明，所有經(jīng)病毒飼養(yǎng)的樣品均產(chǎn)生較強(qiáng)的雜交信號，而陰性對照基本無雜交信號。

用所標(biāo)記的EcobNPV探針對供試的茶毛蟲、茶刺蛾、茶尺蠖核型多角體病毒和茶小卷葉蛾顆粒體病毒進(jìn)行斑點雜交法檢測。結(jié)果表明（圖5），除茶尺蠖核型多角體病毒（湖北分離株、安徽分離株）外，其他病毒均未產(chǎn)生雜交信號，而陰性對照也沒有雜交信號產(chǎn)生，表明所標(biāo)記探針檢測EcobNPV具有很好的特異性。

3 討論

在利用昆蟲病毒防治茶園害蟲的過程中，病毒檢測技術(shù)的靈敏度和可操作性是影響生物防治效果的重要制約因子。已報道的用于昆蟲病毒檢測的方法主要有ELISA和PCR[15]，但蟲體在初感染病毒后由于病毒含量較低，使用常規(guī)的ELISA靈敏度不夠，而使檢測結(jié)果呈現(xiàn)陰性。此外，PCR用于病毒檢測時需對多個樣品分別操作，不適合大批量樣品的同時檢測。本研究采用地高辛標(biāo)記的DNA探針，通過斑點雜交，并結(jié)合化學(xué)發(fā)光顯影，能有效檢測茶園中各種核型多角體病毒，其特異性強(qiáng)，靈敏度較ELISA更高，在單位膜上可同時檢測大量樣品，且所制備的探針溶液可多次重復(fù)使用。因此，該技術(shù)應(yīng)用于茶園茶尺蠖種群帶毒狀況和病毒材料的篩選更具優(yōu)勢。

利用病毒防治茶尺蠖已成為目前茶園生物防治的一個亮點，具有廣闊的應(yīng)用前景。病毒檢測是茶園生物防治和有機(jī)茶生產(chǎn)過程中的一個重要環(huán)節(jié)。因此，EcobNPV核酸斑點雜交檢測技術(shù)的建立有利于了解茶園中病毒的發(fā)生與分布情況，也為有機(jī)茶園的推廣提供了技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)

[1] 殷坤山，陳華才.噴施茶尺蠖病毒殺蟲劑對茶葉品質(zhì)的影響[J].中國茶葉，2002，24（4）：5.

[2] 張益民，王學(xué)蘭，張世敏，等.茶尺蠖核型多角體病毒超微結(jié)構(gòu)的初步研究[J].科學(xué)通報，1985（24）：1918-1920.

[3] 葉恭銀，胡 萃，朱俊慶，等.高溫條件下茶尺蠖核型多角體——病毒對茶尺蠖繁殖的影響[J].中國病毒學(xué)，1992，7（3）：283-288.

[4] 葉恭銀，胡 萃，朱俊慶.茶尺蠖核型多角體病毒對宿主幼蟲食物攝取與利用的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，21（1）：77-80.

[5] 葉恭銀，朱俊慶，胡 萃.茶尺蠖核型多角體病毒對宿主種群的控制作用[J].植物保護(hù)學(xué)報，1994，21（3）：231-237.

[6] 胡 萃，葉恭銀，林高明.茶尺蠖NPV對茶尺蠖幼蟲取食及生長發(fā)育的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，16 （2）：113-118.

[7] 張益民，趙懷宇，張建紅，等.茶尺蠖核型多角體病毒研究[J].生物防治通報，1989，5（4）：168-172.

[8] 曲良建，張永安，王玉珠，等.PCR法證實棉鈴蟲核型多角體病毒對棉鈴蟲經(jīng)卵和蛹的垂直傳播[J].中國生物防治，2005，21（1）：45-48.

[9] GALIPIENSO L，VIVES M C，NAVARRO L，et al. Detection of citrus leaf blotch virus using digoxigenin-labeled cDNA probes and RT-PCR[J]. European Journal of Plant Pathology，2004， 110（2）：175-181.

[10] 常國輝，陳繩亮，羅保君，等.茶毛蟲核型多角體病毒（EpNPV）多角體蛋白基因的定位及克隆[J].中國病毒學(xué)，2001，16（4）：390-392.

[11] 陳繩亮，羅保君，常國輝，等.茶毛蟲核型多角體病毒基因組酶切分析及質(zhì)粒文庫的構(gòu)建[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，18（4）：303-306.

[12] KUKAN B， MYERS J H.DNA hybridization assay for detection of nuclear polyhedrosis virus in tent caterpillarst[J].Journal of Invertebrate Pathology，1995，66（3）：231-236.

[13] MA X C，SHANG J Y， YANG Z N，et al. Genome sequence and organization of a nucleopolyhedrovirus that infects the tea looper caterpillar， Ectropis oblique[J].Virology，2007，360（1）：235-246.

[14] HUGHES D S，POSSEE R D，KING L A.Activation and detection of a latent baculovirus resembling Mamestra brassicae nuclear polyhedrosis virus in M. brassicae insect[J].Virology，1993，194（2）：608-615.

[15] 王文歡，曲良建，王玉珠，等.基于PCR方法的美國白蛾核型多角體病毒早期檢測[J].昆蟲學(xué)報，2009，52（6）：707-712.