顯性標(biāo)記在廣兩優(yōu)476種子純度鑒定中的應(yīng)用

摘要：廣兩優(yōu)476是廣占63-4S和R476配組而成的兩系中秈新組合，其父本R476是利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)育成的含有抗褐飛虱基因Bph14的恢復(fù)系。根據(jù)水稻抗褐飛虱基因Bph14的序列設(shè)計(jì)顯性標(biāo)記76-3用于鑒定廣兩優(yōu)476的種子純度。結(jié)果表明，用顯性標(biāo)記鑒定兩系雜交稻的種子純度，方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞：顯性標(biāo)記；廣兩優(yōu)476；純度鑒定

中圖分類號(hào)：S339.3；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5884-03

廣兩優(yōu)476是利用不育系廣占63-4S和恢復(fù)系R476配組育成的兩系中秈新組合，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)和熟期適宜等特點(diǎn)，并于2010年3月通過了湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)的審定[1]。2011-2013年，廣兩優(yōu)476連續(xù)3年被湖北省農(nóng)業(yè)廳確定為水稻主導(dǎo)品種之一，正在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。

由于光溫敏不育系在自然環(huán)境條件下易受到光溫等條件的影響，因此在制種期間若出現(xiàn)異常低溫可能引起不育系育性波動(dòng)，導(dǎo)致不育系部分自交結(jié)實(shí)從而影響雜交種子的純度；另外，由于制種時(shí)隔離不嚴(yán)，或收獲、裝運(yùn)等環(huán)節(jié)人為因素的影響，也可能造成串粉混雜或機(jī)械混雜。因此，探索一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速地鑒定兩系雜交稻種子純度的方法是保證兩系雜交稻安全推廣應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

分子標(biāo)記鑒定雜交水稻種子純度已有不少報(bào)道[2-4]，但大多是利用共顯性SSR標(biāo)記，由于SSR標(biāo)記往往在親本間差異較小，需要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳或高分辨率的瓊脂糖凝膠電泳才能區(qū)分。這就增加了分子檢測(cè)的難度和鑒定成本，而一般的顯性標(biāo)記對(duì)于某一個(gè)品種來講由于特異性不強(qiáng)而無法使用?？购诛w虱基因Bph14來自于野生稻，已經(jīng)被定位[5]和克隆[6]，與其緊密連鎖的分子標(biāo)記MRG2329也已經(jīng)成功應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種中，通過分子標(biāo)記輔助選擇鑒定了育成的恢復(fù)系R476及其雜交組合廣兩優(yōu)476帶有抗褐飛虱基因Bph14[7，8]。本研究針對(duì)雜交組合廣兩優(yōu)476，利用Bph14基因特異的顯性標(biāo)記76-3對(duì)種子純度鑒定的方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

不育系廣占63-4S、恢復(fù)系R476和廣兩優(yōu)476種子采自湖北鄂科華泰種業(yè)股份有限公司制種基地。不同制種田收獲的種子編號(hào)后隨機(jī)抽樣分成2份，一份在海南省進(jìn)行田間種植鑒定，設(shè)計(jì)3次重復(fù)，每重復(fù)單本種植500苗；另一份取200粒種子浸種催芽后放置培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，1周后取單株葉片，采用CTAB法[9]從葉片中提取DNA，利用顯性標(biāo)記76-3鑒定種子純度。

1.2 試劑

Taq酶、dNTPs、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；MRG2329引物序列由武漢大學(xué)何光存教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：1.5 μL 10×PCR Buffer （100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，pH 8.3），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.6 μL 上、下游引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），1.0 μL 模板DNA，補(bǔ)ddH2O至15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，退火 30 s（MRG2329的退火溫度為60 ℃，76-3的退火溫度為58 ℃），72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。MRG2329的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)[7]，76-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記MRG2329和76-3在廣兩優(yōu)476親本及雜交種中的多態(tài)性

MRG2329為共顯性標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為180 bp，由于親本間差異較小，需使用聚丙烯酰胺凝膠電泳才能分辨，電泳結(jié)果見圖1a。含Bph14基因的恢復(fù)系R476片段稍大，不育系廣占63-4S的片段較小，雜交種廣兩優(yōu)476為雜合帶，利用MRG2329擴(kuò)增片段大小的差異能將恢復(fù)系、不育系和雜交種區(qū)分。76-3為顯性標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為570 bp，電泳結(jié)果見圖1b。含Bph14基因的恢復(fù)系R476和雜交種廣兩優(yōu)476有擴(kuò)增產(chǎn)物，不育系廣占63-4S無擴(kuò)增產(chǎn)物，利用擴(kuò)增產(chǎn)物的有無能將雜交種和不育系區(qū)分，因此用顯性標(biāo)記76-3可以檢測(cè)出雜交種中混雜的不育系種子。

2.2 利用顯性標(biāo)記76-3鑒定雜交水稻廣兩優(yōu)476種子的純度

為了便于操作，每組樣品隨機(jī)提取94個(gè)單樣，以父本R476和母本63-4S分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，利用顯性標(biāo)記76-3對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增時(shí)使用96孔PCR板，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。為了節(jié)約成本，第一次點(diǎn)樣的產(chǎn)物在200 V電壓下電泳20～30 min后進(jìn)行第二次點(diǎn)樣，電泳結(jié)束后拍照統(tǒng)計(jì)無擴(kuò)增產(chǎn)物樣的個(gè)數(shù)（圖2）。1號(hào)樣品的檢測(cè)結(jié)果，第52個(gè)樣和第86個(gè)樣與對(duì)照63-4S （第95個(gè)）無擴(kuò)增產(chǎn)物，表明94個(gè)檢測(cè)樣品中鑒定出2個(gè)不育系，最后計(jì)算出1號(hào)樣品種子的純度為97.9%（表2）。

2.2 分子標(biāo)記鑒定與田間種植鑒定結(jié)果的比較

本研究中田間鑒定的結(jié)果見表2。從表2中可以看到，3次重復(fù)的平均值與分子鑒定結(jié)果之間存在一定的差異，兩者的差值在-7.9～2.4之間。13號(hào)樣品分子鑒定純度比田間鑒定純度高出7.9個(gè)百分點(diǎn)。部分樣品的田間鑒定純度大于分子鑒定純度，如4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)和12號(hào)；另一部分樣品的田間鑒定純度小于分子鑒定純度，如2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、11號(hào)和13號(hào)，只有1號(hào)和8號(hào)樣品的田間鑒定與分子鑒定結(jié)果相同。在13個(gè)樣品中，除3號(hào)、4號(hào)和13號(hào)外，其他樣品的田間鑒定與分子鑒定結(jié)果差值都在1個(gè)百分點(diǎn)內(nèi)，說明分子鑒定的結(jié)果基本能反映出所鑒定樣品的種子純度。同時(shí)從表2還可看到，田間鑒定3次重復(fù)的結(jié)果也存在一定的差異，重復(fù)間差異最小的是4號(hào)，其差值在0.4%～1.0%之間，差異最大的是5號(hào)，其差值在2.4%～13.2%之間；田間鑒定與分子鑒定差異最大的是13號(hào)，3次重復(fù)間的差異也較大，其差值在5.4%～10.8%之間，說明抽樣過程中不同的樣本帶來的鑒定結(jié)果的差異是不可避免的，只有通過加大檢測(cè)樣本或取平均值的方法來加以修正。

3 小結(jié)與討論

3.1 顯性標(biāo)記鑒定雜交稻種子純度的優(yōu)點(diǎn)

在兩系雜交稻制種過程中，如果隔離條件符合技術(shù)要求，并且沒有發(fā)生機(jī)械混雜，對(duì)種子純度產(chǎn)生影響的因素主要是不育系自交結(jié)實(shí)。在這種情況下利用恢復(fù)系特異的顯性標(biāo)記就能準(zhǔn)確鑒定種子純度。與田間鑒定相比，待測(cè)樣品在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)1周后就可以提取葉片DNA，縮短了鑒定時(shí)間。與共顯性標(biāo)記相比，顯性標(biāo)記只需判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，容易識(shí)別，而且電泳時(shí)間短，一排點(diǎn)樣孔上可多次上樣，節(jié)約了時(shí)間和成本，提高了效率。

3.2 影響分子鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的因素

在田間鑒定中發(fā)現(xiàn)廣兩優(yōu)476中有少量的秈粳交雜株、異型株和恢復(fù)系。對(duì)于串粉混雜和異型株等類型的雜株，由于不帶有Bph14基因，用顯性標(biāo)記76-3鑒定時(shí)這類雜株與混雜的不育系一樣擴(kuò)增不出目的條帶，只能鑒定為雜株而無法判定是哪種類型，但并不影響鑒定的結(jié)果；對(duì)于混雜的恢復(fù)系，由于帶有Bph14基因，用76-3也能擴(kuò)增出目的條帶，無法與真雜種區(qū)分，可能會(huì)影響鑒定結(jié)果。本研究中只在2號(hào)和9號(hào)樣品中各發(fā)現(xiàn)了1株恢復(fù)系，所占比例較小，對(duì)分子鑒定結(jié)果并未產(chǎn)生影響。而恢復(fù)系對(duì)雜交種子純度的影響，在制種過程中可以通過嚴(yán)格管理人為控制。

用顯性標(biāo)記76-3鑒定廣兩優(yōu)476種子純度，擴(kuò)增無目的條帶即判定為雜株，但由于DNA質(zhì)量的問題也可能引起擴(kuò)增無條帶，增加了雜株的比例。這就要求在提取DNA時(shí)，保證所提取DNA的質(zhì)量。由于無擴(kuò)增條帶的樣品所占比例較少，還可以使用顯性標(biāo)記MRG2329將這些樣品重新檢測(cè)一次，排除DNA的影響，確定雜株的數(shù)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)上一般抽樣的樣品數(shù)量越多統(tǒng)計(jì)數(shù)與總體參數(shù)之差就越小。在實(shí)際工作中，只要誤差在允許范圍內(nèi)，抽樣數(shù)量要盡可能小，否則工作量加大，會(huì)相應(yīng)增加檢測(cè)費(fèi)用[10]。根據(jù)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 3543.5-1995中對(duì)聚丙烯酰胺凝脈電泳法測(cè)定大麥、小麥種子純度的規(guī)定，一般每個(gè)樣品測(cè)定100粒種子[11]。在本研究中PCR擴(kuò)增時(shí)使用的是96孔板，每次擴(kuò)增94個(gè)待測(cè)樣品，如果鑒定結(jié)果在90%以下，可直接判定為種子純度不合格，如本研究中的3號(hào)、5號(hào)和13號(hào)樣品。如果鑒定結(jié)果在96%左右（根據(jù)國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)雜交稻種子純度不低于96%），可根據(jù)需要重新提取DNA再檢測(cè)94個(gè)樣品或更多的樣品。

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