玉米淹水誘導(dǎo)表達(dá)ZmERF5基因啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析

摘要： 根據(jù)玉米（Zea mays L.）自交系B73 ZmERF5基因啟動(dòng)子的DNA序列，利用PCR技術(shù)分別從玉米自交系Hz32（耐漬系）、Mo17（敏感系）中克隆出該啟動(dòng)子。ZmERF5基因啟動(dòng)子在Hz32和Mo17中DNA序列沒(méi)有差異，大小均為1 098 bp。生物信息學(xué)分析表明，ZmERF5基因啟動(dòng)子含有多個(gè)厭氧響應(yīng)順式元件：2個(gè)GARE motif、2個(gè)MBS、1個(gè)ABRE motif、1個(gè)TCA element、1個(gè)CGTCA motif、1個(gè)G box和1個(gè)O2-site。因此，推斷該啟動(dòng)子受激素調(diào)控，且是淹水誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）；淹水脅迫；誘導(dǎo)表達(dá)；啟動(dòng)子

中圖分類號(hào)：S512.1；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5880-04

洪澇災(zāi)害給農(nóng)作物造成了很大的損失，僅南亞地區(qū)每年有超過(guò)15%的玉米（Zea mays L.）種植面積遭受不同程度的危害[1]。玉米是我國(guó)種植面積最大的農(nóng)作物之一[2]，但由于南方地區(qū)季節(jié)性降雨，玉米苗期經(jīng)常遭受綿綿春雨，花期和灌漿期則往往遭遇梅雨，排灌系統(tǒng)不良、低洼地區(qū)的春玉米經(jīng)常遭受洪澇災(zāi)害。我國(guó)受洪澇災(zāi)害的農(nóng)田面積平均每年達(dá)956萬(wàn)hm2，其中嚴(yán)重的年份，受災(zāi)面積達(dá)1 500萬(wàn)hm2以上[3]。

乙烯反應(yīng)因子（Ethylene response factors，ERF）是乙烯信號(hào)途徑調(diào)控的重要因子，參與植物生物和非生物脅迫的表達(dá)調(diào)控[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)ERF基因參與了水稻（Oryza sative L.）和深水稻的淹水脅迫響應(yīng)。在淹水條件下Sub1A基因可以抑制乙烯的產(chǎn)生，限制葉片和節(jié)間的伸長(zhǎng)，降低葉綠素的降解和碳水化合物的消耗，而使水稻生長(zhǎng)處于“靜止”狀態(tài)，并在退水后能迅速恢復(fù)生長(zhǎng)[7]。Xu等[8]克隆了Sub1A基因，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Sub1A基因?qū)氲讲荒脱退木静牧现校岣吡四脱退?。Hattori等[9]從深水稻中克隆了2個(gè)ERF基因，分別是SNORKEL1和SNORKEL2。淹水條件下，深水稻體內(nèi)乙烯的積累，誘導(dǎo)了SNORKEL1和SNORKEL2基因的表達(dá)，促進(jìn)了節(jié)間的顯著伸長(zhǎng)，從而使深水稻的莖稈伸出水面，避免遭受溺亡。擬南芥（Arabidopsis thaliana）RAP2.2也是一個(gè)ERF基因，在根部表達(dá)量較高。轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實(shí)上調(diào)RAP2.2基因的表達(dá)，提高了擬南芥耐淹水性，相反敲除RAP2.2基因，擬南芥對(duì)淹水非常敏感；同時(shí)，RAP2.2基因上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，其ADH1和PDC酶的活性較高[10]。

以上研究表明，ERF基因參與了水稻、深水稻和擬南芥的淹水脅迫響應(yīng)，是耐淹澇的關(guān)鍵基因。課題組使用生物信息學(xué)方法，從玉米基因組中獲得了107個(gè)ERF基因，并使用RNA-seq技術(shù)，分析了這些基因在玉米自交系Hz32（耐漬系）根系不同淹水條件下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ZmERF2基因受淹水脅迫誘導(dǎo)表達(dá)（待發(fā)表）。本研究分別從玉米自交系Hz32和Mo17（敏感系）中克隆出了ZmERF2基因的啟動(dòng)子，并對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，將有助于進(jìn)一步揭示玉米耐漬性形成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

耐漬性較強(qiáng)的玉米自交系Hz32和耐漬性較弱的玉米自交系Mo17，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張祖新教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 玉米基因組DNA的提取 利用改進(jìn)的CTAB法[11]分別提取玉米自交系Hz32和Mo17的基因組DNA。

1.2.2 玉米根系總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 玉米自交系Mo17、Hz32于三葉一心期，分別進(jìn)行0、4 h的淹水處理。使用植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），分別提取各處理根系的總RNA。將各處理的總RNA作為模板，使用cDNA第一鏈合成試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），分別合成cDNA第一鏈。

1.2.3 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)玉米自交系B73 ZmERF5基因序列，分別設(shè)計(jì)用于RT-PCR和PCR擴(kuò)增的引物，引物序列見(jiàn)表1。引物GSP1-F、GSP1-R用于RT-PCR，分析不同淹水處理ZmERF5基因在Mo17、Hz32根系的表達(dá)情況。引物GSP2-F、GSP2-R用于PCR擴(kuò)增ZmERF5基因啟動(dòng)子。

1.2.4 ZmERF5基因表達(dá)的RT-PCR分析 分別提取淹水0、4 h處理的Mo17、Hz32根系總RNA，并分別合成cDNA第一鏈。將合成的cDNA第一鏈作為模板，進(jìn)行RT-PCR分析。RT-PCR擴(kuò)增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取8.0 μL RT-PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并于凝膠成像系統(tǒng)拍照、保存。

1.2.5 ZmERF5基因啟動(dòng)子的克隆 分別以Mo17、Hz32的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，63 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的回收與測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)公司），回收PCR產(chǎn)物?；厥盏腜CR產(chǎn)物，克隆到T-vector中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選重組子。經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定后，陽(yáng)性克隆送至北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 測(cè)序得到的Hz32和Mo17的ZmERF5基因啟動(dòng)子序列用ClustalX軟件進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。將ZmERF5基因啟動(dòng)子的序列用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmERF5基因表達(dá)分析

玉米自交系Hz32和Mo17三葉一心期淹水處理0、4 h，然后提取總RNA用于RT-PCR。RT-PCR結(jié)果表明，玉米自交系Hz32和Mo17在淹水0 h處理時(shí)，沒(méi)有條帶，即淹水0 h處理時(shí)ZmERF5基因在Hz32和Mo17中都不表達(dá)；在淹水4 h處理時(shí)有單一的亮帶，但Hz32的亮帶比Mo17的亮，即ZmERF5基因在Hz32和Mo17中都表達(dá)了（圖1）。由此可得，ZmERF5基因是淹水誘導(dǎo)表達(dá)的基因，其啟動(dòng)子也應(yīng)該是受淹水誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

2.2 ZmERF5基因啟動(dòng)子的測(cè)序結(jié)果

玉米ZmERF5基因啟動(dòng)子測(cè)序結(jié)果顯示，Hz32和Mo17的ZmERF5基因啟動(dòng)子片段大小均為 1 372 bp。為得到完整的啟動(dòng)子序列，下游引物跨過(guò)了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，即1 372 bp片段中含有非啟動(dòng)子片段。與ZmERF5基因cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)在 1 372 bp的序列3′端有274 bp的非啟動(dòng)子序列，剔除這個(gè)非啟動(dòng)子序列得到1 098 bp完整的ZmERF5啟動(dòng)子序列（圖2）。

2.3 ZmERF5基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析

利用PlantCARE在線軟件分析ZmERF5基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)（圖3）顯示，玉米ZmERF5基因啟動(dòng)子的正鏈中含有1個(gè)CAAT box（-2～-7 bp）；2個(gè)CCAAT box（-161～-154 bp、-848～-842 bp）；1個(gè)TATA box（-70～-64 bp）；2個(gè)GARE motif（-208～-201 bp、-624～-617 bp）；2個(gè)MBS（-294～-288 bp、-597～-591 bp）；1個(gè)ABRE motif（-122～-113 bp）；1個(gè)TCA element（-203～-194 bp）；1個(gè)CGTCA motif（-29～-24 bp）；1個(gè)G box（-1 090～-1 084 bp）；1個(gè)MSA-like（-850～-841 bp）；1個(gè)O2-site（-572～-563 bp）。在其負(fù)鏈中還含有1個(gè)ARE（-272～-265 bp）和1個(gè)GC box（-310～-303 bp）。

3 小結(jié)與討論

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。淹水誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在受到淹水刺激后，驅(qū)動(dòng)下游基因的高效表達(dá)，對(duì)淹水脅迫做出應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)植物處于淹水狀態(tài)時(shí)，由于缺氧而對(duì)缺氧或低氧環(huán)境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。研究已經(jīng)證實(shí)，厭氧響應(yīng)元件（ARE）、GCmotif、GTmotif、Gbox、MYBmotif和GCC box 是厭氧脅迫反應(yīng)啟動(dòng)子的很重要的順式調(diào)控元件，如玉米的乙醇脫氫酶基因（adh）啟動(dòng)子[12]和擬南芥的丙酮酸脫氫酶基因（pdc）啟動(dòng)子[13]。Walker等[14]研究指出，ARE是玉米adh基因厭氧表達(dá)所必需的調(diào)控元件。玉米的ARE中含有1個(gè)41 bp的啟動(dòng)子近端區(qū)域，該區(qū)域包含2個(gè)亞區(qū)，每個(gè)亞區(qū)含有1個(gè)GC-rich和GT-rich區(qū)域，這2個(gè)區(qū)域?qū)虻娜毖跽T導(dǎo)表達(dá)是必需的。Yamaguchi-Shinozaki等[15]對(duì)擬南芥Atmyb2基因進(jìn)行序列分析并在不同脅迫環(huán)境下對(duì)該基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Atmyb2轉(zhuǎn)錄因子與Atmyb2基因上的MYB元件結(jié)合，對(duì)水分脅迫和ABA應(yīng)答，并鑒定出了MYB結(jié)合位點(diǎn)的核心序列為C/TAACNA/G。

在本研究中發(fā)現(xiàn)玉米ZmERF5基因在自交系Hz32和Mo17中淹水0 h都不表達(dá)，淹水4 h都表達(dá)。啟動(dòng)子序列分析顯示，ZmERF5啟動(dòng)子中除含有真核生物啟動(dòng)子的基本保守序列TATA-box、CAAT-box外，還含有與其他淹水誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相同的順式作用元件，即ZmERF5啟動(dòng)子中有2個(gè)MBS、1個(gè)G-box，在其負(fù)鏈上還有1個(gè)ARE和1個(gè)GCbox，除此之外，還有ABREmotif、GAREmotif、TCAelement、CGTCAmotif等激素響應(yīng)元件。本研究對(duì)闡明玉米淹水脅迫響應(yīng)形成的分子機(jī)理以及玉米和其他旱生作物耐漬性的遺傳改良，具有十分重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] RATHORE T R， WARSI M Z K， SINGH N N， et al. Water-logging problem for maize production in Asian region[J]. TAMNET News Letters，1997（4）：13-14.

[2] 戴景瑞，鄂立柱.我國(guó)玉米育種科技創(chuàng)新問(wèn)題的幾點(diǎn)思考[J].玉米科學(xué)，2010，18（1）：1-5.

[3] 馮相昭，鄒 驥，馬 珊，等.極端氣候事件對(duì)中國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)影響的評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)經(jīng)濟(jì)，2007（2）：19-25.

[4] CAO Y F， SONG F M， GOODMAN R M， et al. Molecular characterization of four rice genes encoding ethylene-responsive transcriptional factors and their expressions in response to biotic and abiotic stess[J]. Journal of Plant Physiology，2006， 163（11）：1167-1178.

[5] ANDERSON J P， LICHTENZVEIG J， GLEASON C， et al. The B-3 ethylene response factor mtERF1-1 mediates resistance to a subset of root pathogens in Medicago truncatula without adversely affecting symbiosis with rhizobia[J]. Plant Physiology，2010，154（2）：861-873.

[6] ZHANG G Y， CHEN M， LI L C， et al. Overexpression of the soybean GmERF3 gene， an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt， drought， and diseases in transgenic tobacco[J]. Journal of Experimental Botany，2009， 60（13）：3781-3796.

[7] FUKAO T， XU K N， RONALD P C， et al. A variable cluster of ethylene response factor-like genes regulates metabolic and developmental acclimation responses to submergence in rice[J]. Plant Cell，2006，18（8）：2021-2034.

[8] XU K N， XU X， FUKAO T， et al. Sub1A is an ethylene-response-factor-like gene that confers submergence tolerance to rice[J]. Nature，2006，442（7103）：705-708.

[9] HATTORI Y， NAGAI K， FURUKAWA S， et al. The ethylene response factors SNORKEL1 and SNORKEL2 allow rice to adapt to deep water[J]. Nature，2009，460（7258）：1026-1031.

[10] HINZ M，WILSON I W，YANG J，et al. Arabidopsis RAP2.2： An ethylene response transcription factor that is important for hypoxia survival[J].Plant Physiology，2010，153（2）：757-772.

[11] 杜何為，黃 敏，張祖新.玉米DNA的小量快速提取[J].玉米科學(xué)，2004，12（2）：36-39.

[12] COLMER T D. Aerenchyma and an inducible barrier to radial oxygen loss facilitate root aeration in upland， paddy and deep water rice（Oryza sativa L.）[J]. Annals of Botany，2003，91（2）：301-309.

[13] THOMAS A L， GUERREIRO S M C， SODEK L. Aerenchyma formation and recovery from hypoxia of the flooded root system of nodulated soybean[J]. Annals of Botany，2005，97（6）：1191-1198.

[14] WALKER J C， HOWARD E A， DENNIS E S， et al. DNA sequence required for anaerobic expression of the maize alcohol dehydrogenase1 gene[J]. Proc Nat Acad Sci，1987，84（19）： 6624-6628.

[15] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K， URAO T， SHINOZAKI K. Regulation of genes that are induced by drought stress in Arabidopsis thaliana[J]. J Plant Res，1995，108（1）：127-136.