PMA—LAMP法對(duì)克氏螯蝦樣品中沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)

摘要：采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（PMA-LAMP）對(duì)克氏螯蝦（Cambarus Clarkii）樣品中沙門(mén)氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)，旨在建立一種快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢驗(yàn)方法。分別采用PMA-LAMP、PCR檢測(cè)方法對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，PMA-LAMP法檢測(cè)限為2×10 CFU/mL，PCR法和GB/T 4789.4-2008檢測(cè)限為2×103 CFU/mL。采集湖北省省內(nèi)60份市售的克氏螯蝦樣品，分別采用PMA-LAMP檢測(cè)方法、PCR檢測(cè)方法及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T 4789.4-2008）對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，PMA-LAMP 方法檢出6例沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性率為10%；PCR檢測(cè)方法檢出4例沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性率為6.7%；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出4例沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性率為6.7%。

關(guān)鍵詞：PMA-LAMP法；沙門(mén)氏菌（Salmonella）；克氏螯蝦（Cambarus Clarkii）

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5854-04

湖北省是小龍蝦（克氏螯蝦，Cambarus clarkii）養(yǎng)殖大省，小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)也引發(fā)了食源性病原微生物污染的食品安全問(wèn)題。2010年7月份以來(lái)，南京陸續(xù)收治因食用克氏螯蝦而入院的病人，經(jīng)檢查診斷為橫紋肌溶解綜合征（哈夫?。?。螯蝦體內(nèi)的藥物殘留、重金屬及攜帶的病原微生物都可能成為哈夫病的致病因素?？耸向r養(yǎng)殖主要分布于低湖田、水稻田、池塘、溝渠等地區(qū)，受生長(zhǎng)環(huán)境的影響，克氏螯蝦體內(nèi)可能寄生多種病原微生物，在養(yǎng)殖、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等諸多環(huán)節(jié)均有可能產(chǎn)生安全隱患，但是這些過(guò)程食品安全隱患很難被發(fā)現(xiàn)，只有進(jìn)入餐飲環(huán)節(jié)后，安全問(wèn)題才得以突顯。因此在小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)中建立快速監(jiān)測(cè)病原微生物的方法及制定標(biāo)準(zhǔn)化的養(yǎng)殖體系迫在眉睫。

沙門(mén)氏菌（salmonella）是最常見(jiàn)的食源性病原微生物，可引起人畜胃腸炎、傷寒和副傷寒等癥[1，2]。人畜感染后可呈無(wú)癥帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，由于其檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜等缺點(diǎn)已不能滿(mǎn)足現(xiàn)代檢測(cè)要求，因此研究沙門(mén)氏菌快速、有效的檢測(cè)方法顯得尤其重要[3-5]。常規(guī)檢測(cè)采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，致病菌需要獨(dú)立的檢測(cè)方法單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)，工作量大，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且受到檢測(cè)人員的專(zhuān)業(yè)、經(jīng)驗(yàn)等多種因素限制，容易出現(xiàn)誤判[6，7]。隨著分子生物學(xué)方法在食品微生物檢測(cè)中的逐步應(yīng)用，致病菌的檢測(cè)效率也逐步提升。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)不斷應(yīng)用于病原微生物的快速檢測(cè)。但PCR技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)適用性上具有一定的局限性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（PMA-LAMP）由Nagamine等[8]于2000年建立，該技術(shù)通過(guò)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域而設(shè)計(jì)4種特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下（60～65 ℃）高效擴(kuò)增目標(biāo)DNA。該方法具有檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。與PCR反應(yīng)相比，PMA-LAMP反應(yīng)最明顯的優(yōu)勢(shì)是不需要高精密的儀器設(shè)備，同時(shí)檢測(cè)靈敏度和特異性又能滿(mǎn)足快速鑒定病原微生物的需要[6]。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028、大腸埃希氏菌ATCC25922、福氏志賀菌CMCC6120513、金黃色葡萄球菌CMCC26003、單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、創(chuàng)傷弧菌ATCC27562均購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

食品中沙門(mén)氏菌PMA-LAMP快速檢測(cè)試劑盒（湖北泰揚(yáng)生物工程有限公司）；疊氮溴化丙錠（Biotium公司）；DNA Marker、Taq酶購(gòu)于北京天根生物有限公司；二甲亞砜（Sigma公司）；緩沖蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、四硫磺酸鹽煌綠增菌液、亞硫酸鉍瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

電熱恒溫水浴鍋（金壇新航儀器有限公司）；S1000型PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；高速離心機(jī)（Sigma公司）；電泳儀（北京六一廠）；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本三洋公司）。

1.4 樣品的制備和選擇性增菌

依據(jù) GB/T4789.4-2008《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行樣品制備和選擇性增菌。

1.4.1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法 依據(jù)GB/T 4789.4-2008《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行菌株的分離和生化鑒定試驗(yàn)。

1.4.2 PCR檢測(cè)方法 根據(jù)GenBank公布的沙門(mén)氏菌invA基因序列，應(yīng)用Primer 5設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物為GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG

CAA；下游引物為T(mén)CATCGCACCGTCAAAGGAACC。

20 μL的擴(kuò)增體系包括：2 μL反應(yīng)液，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL （0.2 μmol/L），2 μL dNTP mixture，1 μL Taq酶，1 μL 25 mmol/L MgSO4，11 μL去離子水。PCR 反應(yīng)體系：94 ℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃（30 s）、56 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）， 72 ℃（10 min）。擴(kuò)增產(chǎn)物在2 %瓊脂糖凝膠上100 V電泳分離60 min，加樣量為5 μL/上樣孔。

1.4.3 疊氮溴化丙錠處理 用20%二甲基亞砜配制40 mmol/L的PMA溶液，-20 ℃避光保存。將PMA（40 mmol/L）依次加入裝有0.5 mL沙門(mén)氏菌活菌菌懸液離心管中，充分混勻后，將離心管于暗室中放置15 min。然后將離心管開(kāi)蓋放置冰上，距鹵鎢燈（500 W）約15 cm，曝光時(shí)間為5 min。

1.4.4 沙門(mén)氏菌DNA模板制備 將過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌菌懸液（2×109 CFU/mL）置于離心管中，依次稀釋為2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL的菌懸液，經(jīng)過(guò)疊氮溴化丙錠處理后，在100 ℃沸水中煮沸5 min，8 000 r/min離心2 min，取上清液作為DNA模板備用。

1.4.5 PMA-LAMP檢測(cè)方法 根據(jù)GenBank公布的沙門(mén)氏菌invA基因序列，應(yīng)用Primer Explorer 4設(shè)計(jì)特異引物。引物序列如表1所示，引物由上海生工合成。PMA-LAMP反應(yīng)體系（25 μL）如下：依次加入10×Thermopol反應(yīng)緩沖液2.5 μL，Bst聚合酶1 μL，引物，dNTP，模板和去離子水。引物FIP和BIP終濃度為1.8 μmol/L；引物F3和B3終濃度為0.2 μmol/L；引物L(fēng)F和LB終濃度為1.0 μmol/L。在62 ℃水浴中反應(yīng)60 min，在85℃水浴中溫浴5 min使酶失活。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上120 V電泳分離60 min，加樣量為5 μL/上樣孔。

1.5 PMA-LAMP檢測(cè)方法的特異性

分別將4株沙門(mén)氏菌和其他5株非沙門(mén)氏菌（依次為大腸埃希氏菌ATCC25922、福氏志賀菌CMCC6120513、金黃色葡萄球菌CMCC26003、單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、創(chuàng)傷弧菌ATCC27562）接種到增菌培養(yǎng)基上，于（36±1） ℃，300 r/min 搖床培養(yǎng)16 h，離心后將菌體依次用無(wú)菌生理鹽水稀釋至2×104 CFU/mL菌懸液，按照“1.4.5”的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 人工污染食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)

1.6.1 不同濃度菌液的制備 挑取沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14028至營(yíng)養(yǎng)肉湯中增菌，于（36±1） ℃，300 r/min 搖床培養(yǎng)16～18 h，用生理鹽水制成菌懸液，依次再用無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋至2×107、2×106、2×105、2×104 CFU/mL。

1.6.2 人工污染樣的制備 將檢測(cè)無(wú)沙門(mén)氏菌污染的克氏螯蝦樣品按GB/T 4789.4-2008方法制成1∶10 稀釋液。吸取制備好的 2×106、2×105、2×104、2×103 CFU/mL菌懸液依次加入每組1∶10 稀釋液中，混勻，菌懸液濃度依次為2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培養(yǎng)12～16 h后分別按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法、PCR檢測(cè)方法及PMA-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)氏菌PCR和PMA-LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果

將鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028按照2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL依次稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)煮沸法提取鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 DNA，將其用于PMA-LAMP反應(yīng)和PCR反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)體系中存在鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 DNA時(shí)，PMA-LAMP檢測(cè)方法擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的、大小不等的DNA重復(fù)序列，凝膠上呈現(xiàn)典型的梯型電泳條帶。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，PCR檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028的檢出限為2×103 CFU/mL，而PMA-LAMP檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028的檢出限為2×10 CFU/mL。

2.2 PMA-LAMP檢測(cè)方法的特異性

4株沙門(mén)氏菌均呈陽(yáng)性反應(yīng)，其他5株非沙門(mén)氏菌（為大腸埃希氏菌ATCC25922、福氏志賀菌CMCC6120513、金黃色葡萄球菌CMCC26003、單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、創(chuàng)傷弧菌ATCC27562均為陰性（圖2）。由圖2可知，按照方法“1.4.3”的擴(kuò)增體系，62 ℃溫育45 min，4株沙門(mén)氏菌在凝膠上呈現(xiàn)典型的梯型電泳條帶，5株非沙門(mén)氏菌均為陰性，去離子水作為陰性對(duì)照，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳無(wú)擴(kuò)增條帶。

2.3 人工污染克氏螯蝦樣品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)結(jié)果

將檢測(cè)無(wú)沙門(mén)氏菌污染的克氏螯蝦樣品按GB/T 4789.4-2008方法制備樣品，菌懸液濃度依次為2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后分別按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法、PCR檢測(cè)方法及PMA-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)（表2）。由表2可知，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法與PMA-LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致。PCR檢測(cè)方法的最低檢出限高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和PMA-LAMP檢測(cè)方法。

2.4 克氏螯蝦樣品的檢測(cè)結(jié)果

采集60份市售的克氏螯蝦樣品，PMA-LAMP 檢測(cè)方法檢出6例沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性率為10%；PCR檢測(cè)方法檢出4例沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性率為6.7%；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出4例沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性率為6.7%。PMA-LAMP檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的陽(yáng)性率差異不顯著性，并且比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限低。

3 結(jié)論

湖北省是水產(chǎn)養(yǎng)殖大省，近年來(lái)湖北省大力發(fā)展克氏螯蝦養(yǎng)殖，其年平均產(chǎn)值達(dá)20億元以上?？耸向r養(yǎng)殖主要集中在水稻田、池塘、溝渠等地，受養(yǎng)殖環(huán)境的影響，克氏螯蝦體內(nèi)可能會(huì)寄生多種病原微生物，由此容易引發(fā)食源性病原微生物問(wèn)題。因此在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)建立食源性病原微生物監(jiān)測(cè)體系，對(duì)食源性病原微生物做到早檢測(cè)早預(yù)防。目前LAMP技術(shù)已被應(yīng)用于食源性病原微生物的快速檢測(cè)，與傳統(tǒng)的快速檢測(cè)方法相比較，PMA-LAMP檢測(cè)方法具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本較低、不需要精密儀器的優(yōu)點(diǎn)，特別適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。本研究建立了快速檢測(cè)克氏螯蝦沙門(mén)氏菌PMA-LAMP檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用PMA-LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)克氏螯蝦樣品中沙門(mén)氏菌，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法比對(duì)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果相同，可為食品安全快速檢測(cè)提供一種新的思路，PMA-LAMP檢測(cè)方法具有快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并能檢測(cè)鑒定沙門(mén)氏菌病原活細(xì)胞[6，9]。

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