機械化學(xué)法提取荷葉總黃酮的工藝研究

摘要：試驗以荷葉總黃酮的提取率為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗對機械化學(xué)法輔助提取荷葉總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，機械化學(xué)法輔助提取荷葉總黃酮的最佳工藝條件為：以水為溶劑，以Na2CO3/Na2B4O7（1∶2，m/m）為助劑，助劑用量（占物料干重）為18%，料液比（g/mL）為1∶40，提取時間為25 min，提取溫度為80 ℃。該工藝條件下，荷葉總黃酮提取率較乙醇法提高了61.1%。機械化學(xué)提取法具有提取率高、時間短、無需有機溶劑、綠色環(huán)保等優(yōu)點，是提取荷葉總黃酮的一種有效方法。

關(guān)鍵詞：機械化學(xué)法；荷葉；總黃酮；正交試驗

中圖分類號：TS201.2；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5825-03

《本草綱目》中記載：“荷葉服之，令人瘦劣，單服可以消陽水浮腫之氣”。荷葉除了含有普通植物所共有的碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)化學(xué)成分外，還含有具有明顯生物活性和生理功能的黃酮類化合物和生物堿這兩大類物質(zhì)[1，2]。目前，中國對于荷葉黃酮的提取主要采用的是醇提法及熱水提取法等傳統(tǒng)提取方法，提取率并不高。醇提法提取過程中乙醇揮發(fā)性強、易燃、操作過程繁瑣、生產(chǎn)成本較高；由于黃酮在水中溶解度較低，水浸法提取效果也不理想。因此，選擇合適的增溶劑以提高水提法的效率有著重要的意義。

機械化學(xué)法包括機械粉碎和固相化學(xué)反應(yīng)兩部分。機械粉碎使植物材料微粉化，增加顆粒比表面積，破碎細(xì)胞壁，暴露有效成分，在物料表面形成新鮮切面，固相化學(xué)助劑在新鮮切面上與有效物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，有效成分被修飾，從而改變了有效成分的溶解特性，進(jìn)而提高了這些成分在特定溶劑中的溶出率[3，4]。本研究采用機械化學(xué)法，以荷葉為原料，以水為溶劑，以荷葉中總黃酮的提取率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗對機械化學(xué)法輔助提取荷葉總黃酮的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件。以期為荷葉黃酮的開發(fā)利用提供一種低廉高效、綠色環(huán)保和有效可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉：采自湖北省荊州市西郊荷塘的睡蓮葉。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、環(huán)糊精、碳酸鈉、碳酸氫鈉、無水硼砂、95%乙醇、無水乙醇等試劑均為分析純。

電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海儀器總廠；高速萬能粉碎機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；723C型可見分光光度計，上海欣茂科學(xué)儀器廠；低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；標(biāo)準(zhǔn)分樣篩，新鄉(xiāng)永清篩分機械有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；PL303型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 機械化學(xué)法提取荷葉總黃酮的工藝 機械化學(xué)法提取荷葉總黃酮的工藝如圖1所示。采摘的原料葉置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，在60 ℃恒溫干燥并粗粉碎后保存?zhèn)溆谩Ｓ?20目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩篩分荷葉粗粉，取篩下的粉末適量并與一定量的研磨助劑混合，投入研磨機中研磨10 min。精確稱取研磨后的細(xì)粉1.0 g，加入50 mL水，室溫攪拌提取10 min，離心，取上清液，沉淀重復(fù)提取2次，合并上清液，濃縮，水定容濾液至50 mL，得供試品溶液。

1）助劑的篩選。荷葉中的黃酮類化合物主要是荷葉苷，其次是槲皮素、異槲皮素等常見的黃酮類物質(zhì)。該類黃酮類物質(zhì)中含有酚羥基，呈酸性，可被堿中和成鹽，在常規(guī)操作中常用堿水加熱提取[1，2]。另外，由于此類黃酮類物質(zhì)分子中的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)易被堿破壞，與堿作用時需加硼酸保護(hù)[3，4]。根據(jù)上述性質(zhì)，本研究選用Na2CO3/Na2B4O7（1∶2，m/m，下同）為助劑共同研磨。

2）單因素試驗和正交試驗。分別考察助劑用量、料液比、提取時間和提取溫度對機械化學(xué)法輔助提取荷葉總黃酮提取率的影響。助劑用量（占物料干重，下同）采用5%、10%、15%、20%、25%、30% 6個水平；料液比（g/mL，下同）采用1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶100 6個水平；提取時間采用10、20、30、40、50、60 min 6個水平；提取溫度采用40、50、60、70、80、90、100 ℃ 7個水平。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平正交試驗（表1），進(jìn)一步優(yōu)化機械化學(xué)法輔助提取荷葉總黃酮的提取工藝。

1.2.2 與乙醇提取法對比試驗 精確稱取荷葉細(xì)粉1.0 g，加入75%乙醇50 mL，室溫[（20±3） ℃]下攪拌提取30 min，測定其總黃酮含量，并與機械化學(xué)法的提取結(jié)果進(jìn)行對比。

1.2.3 荷葉總黃酮含量的測定 采用以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的比色法測定荷葉總黃酮的含量。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。參照文獻(xiàn)[1]的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以黃酮質(zhì)量x（mg）與吸光度y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=0.306x-0.128 3，R2=0.997 8。

2）荷葉總黃酮含量的測定。吸取供試品溶液1.0 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1.0 mL，放置6 min，加10%Al（NO3）3 溶液1.0 mL，放置6 min，加4%NaOH 溶液10 mL，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min以上，以上述不含供試品溶液的試液作空白，于500 nm處測定其吸光度。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得黃酮質(zhì)量，再除以樣品質(zhì)量即為黃酮的提取率（mg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 機械化學(xué)法的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 助劑用量對荷葉總黃酮提取率的影響 助劑用量對荷葉總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)助劑Na2CO3/Na2B4O7用量小于20%時，隨著助劑用量的增加，荷葉總黃酮提取率也不斷增加，助劑用量大于20%以后，荷葉總黃酮的提取率趨于穩(wěn)定。表明在本試驗條件下，添加20%的Na2CO3/Na2B4O7即可使荷葉中的總黃酮物質(zhì)與堿充分作用。

2.1.2 料液比對荷葉總黃酮提取率的影響 料液比對荷葉總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著溶劑用量的增大，荷葉中總黃酮的提取率逐漸增加，在料液比為1∶50時達(dá)到最大，之后隨溶劑用量的進(jìn)一步增加，荷葉總黃酮提取率的變化幅度不大，趨于穩(wěn)定，故選擇料液比1∶50為宜。

2.1.3 提取時間對荷葉總黃酮提取率的影響 提取時間對荷葉總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨提取時間的增加，荷葉中總黃酮的提取率有較為明顯的增加，在經(jīng)過30 min的提取后，荷葉中總黃酮的提取率就逐漸趨于穩(wěn)定。故提取時間選擇30 min。

2.1.4 提取溫度對荷葉總黃酮提取率的影響 提取溫度對荷葉總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨提取溫度的升高，荷葉總黃酮提取率呈逐漸上升的趨勢，在80 ℃時達(dá)到最大，之后隨提取溫度進(jìn)一步增加提取率呈下降趨勢。故提取溫度選擇80 ℃左右為宜。

2.2 正交試驗與驗證試驗結(jié)果

由表2可見，機械化學(xué)法輔助提取荷葉總黃酮的最佳工藝組合為A1B3C1D1，即助劑Na2CO3/Na2B4O7用量為18%，提取溫度為85 ℃，料液比為1∶40，提取時間為25 min。各因素對總黃酮提取率的影響次序為料液比>提取溫度>提取時間>助劑用量。由方差分析結(jié)果（表3）可知，料液比對荷葉總黃酮提取率的影響極顯著（P<0.01），其他3因素影響不顯著。在最佳工藝組合條件下，分別進(jìn)行驗證試驗3次，其平均提取率為4.06 mg/g。

2.3 與乙醇提取法對比試驗結(jié)果

精確稱取荷葉細(xì)粉1.0 g，加入50 mL 75%乙醇，室溫[（20±3） ℃]下攪拌提取30 min，測定其總黃酮含量，并與機械化學(xué)法在最佳工藝組合條件下的提取結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果如表4所示。由表4可知，機械化學(xué)法對荷葉總黃酮的提取率較乙醇提取法高61.1%，表明用機械化學(xué)法提取荷葉總黃酮是一種高效環(huán)保的方法。

3 結(jié)論

機械化學(xué)法提取荷葉總黃酮的最佳工藝條件為：以Na2CO3/Na2B4O7為助劑，用量為18%，提取時間25 min，提取溫度85 ℃，料液比1∶40。采用機械化學(xué)法（用水做溶劑）代替乙醇提取法提取荷葉總黃酮，具有既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的效果。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 黃阿根，周蘭香，謝凱舟，等.荷葉黃酮的化學(xué)吸光法及高效液相色譜法分析研究[J].揚州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2000，3（4）：46-51.

[3] 劉 瑩. 機械化學(xué)輔助提取刺五加有效成分的工藝研究[D].遼寧大連：大連理工大學(xué)，2007.

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