鴨黃病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

摘要：根據(jù)鴨黃病毒HBJL株NS5基因序列設(shè)計(jì)合成了引物和探針，通過(guò)對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)鴨黃病毒的方法。結(jié)果表明，該方法具有很好的特異性和重復(fù)性，熒光定量PCR敏感性是常規(guī)PCR的100倍左右。同時(shí)對(duì)30枚人工接種的鴨胚進(jìn)行檢測(cè)并與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，檢測(cè)結(jié)果也表明熒光定量PCR法比常規(guī)PCR的敏感性高。

關(guān)鍵詞：鴨黃病毒；TaqMan探針；熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+9.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5811-03

2010年以來(lái)，中國(guó)上海、浙江、江蘇等地出現(xiàn)了蛋鴨產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降及蛋鴨死亡現(xiàn)象。同年在湖北省一些養(yǎng)鴨場(chǎng)也出現(xiàn)不明原因引起的產(chǎn)蛋量下降現(xiàn)象，臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降甚至停止，且蛋鴨有一定的死亡率，剖檢病死鴨脾臟呈現(xiàn)明顯腫大，卵巢肉變，卵泡嚴(yán)重充血，出血[1]。

臨床診斷為鴨黃病毒感染引起的病毒病感染，該病的發(fā)生給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了提高鴨黃病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和高效性，本研究擬建立一種能用于該病檢測(cè)的一步法熒光定量PCR方法，為鴨黃病毒的流行病學(xué)、致病機(jī)理及診斷與防治等方面提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨黃病毒HBJL株為動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，該毒株用8～12日齡的鴨胚增殖。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DEPC、dNTPs、Mg2+均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Trans DNA Marker Ⅲ購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司；Viral RNA Mini Kit（50）購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針 根據(jù)鴨黃病毒HBJL株NS5基因序列（GenBank No. JF423123），使用Primer Primier 5軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物和1條探針。上游引物（DFV-F）序列為：5′-atgaataaggtggtgaaggtaatgc-3′，下游引物（DFV-R）序列為：5′-cagattcgtgaaagtgttgagagc-3′，熒光探針（DFV-P）序列為：5′-catgactgttttcccatcacgtcccgg-3′，熒光探針DFV-P 5′端標(biāo)記的是熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。引物和探針均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，TE中溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ顳FV-F和DFV-R用于熒光定量擴(kuò)增，目的片斷長(zhǎng)130 bp。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及病毒含量的檢測(cè) 將毒株HBJL接種8～12日齡的鴨胚后，觀察5～7 d收集死亡鴨胚的胚體、尿囊膜和尿囊液，并混合研磨。凍融3次后12 000 r/min離心3次取上清即為病毒液，測(cè)定病毒含量為103.7 ELD50（0.2 mL）（Median embryo lethal dose，ELD50），將病毒原液稀釋為原來(lái)的1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后接種8～12日齡鴨胚，每個(gè)稀釋度接種5枚鴨胚。然后將病毒上清液用Viral RNA Mini Kit提取RNA，加DEPC水溶解RNA后，-70 ℃保存作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.3.3 一步法熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 用矩陣法對(duì)熒光定量PCR的引物濃度、探針濃度、Mg2+濃度等進(jìn)行篩選優(yōu)化，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

熒光定量檢測(cè)的循環(huán)條件為：42 ℃ 20 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 50 s，50個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)定在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為530 nm，自動(dòng)計(jì)算出Ct值并給出定量結(jié)果。

1.3.4 熒光定量PCR與常規(guī)PCR敏感性比較試驗(yàn) 為了比較熒光定量PCR與常規(guī)PCR的敏感性，用10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品（病毒含量為103.7、102.7、101.7、100.7、10-0.3、10-1.3、10-2.3 ELD50）為定量檢測(cè)模板，用動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行建立的常規(guī)PCR及熒光定量PCR對(duì)檢測(cè)模板進(jìn)行檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果作為常規(guī)PCR的敏感性與熒光定量PCR檢測(cè)的敏感性進(jìn)行分析比較[1]。

1.3.5 特異性試驗(yàn) 為驗(yàn)證本方法的特異性，同時(shí)提取禽流感、禽白血病、禽大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、鴨疫里默氏桿菌、新城疫、減蛋綜合征病鴨鴨胚的RNA，在相同條件下進(jìn)行熒光定量PCR，觀察反應(yīng)的特異性。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取鴨黃病毒濃度為102.7、101.7、100.7 ELD50作為檢測(cè)模板，用熒光定量PCR方法進(jìn)行組間重復(fù)性檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 人工感染鴨胚的檢測(cè) 用鴨黃病毒HBJL株的病毒尿囊液1∶1 000稀釋后，卵黃囊接種8～12日齡鴨胚30枚，0.2 mL/只，另設(shè)接種生理鹽水為陰性對(duì)照組，連續(xù)觀察5 d后收集鴨胚，棄去24 h內(nèi)死亡的鴨胚，取尿囊液及胚體胚膜，加生理鹽水研磨后，凍融3次，離心取上清液；陰性對(duì)照組的鴨胚在觀察5 d后取尿囊液及胚體胚膜，研磨后凍融3次離心取上清液。將所有待檢上清液提取RNA應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)，同時(shí)用常規(guī)PCR檢測(cè)，比較兩者檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

反應(yīng)總體系20 μL，其組成為： 10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品的RNA 10 μL，10×PCR Buffer 2 μL，50 mmol/L MgCl2 1.6 μL， 25 mmol/L dNTPs 0.4 μL， 500 U/μL M-MLV酶0.2 μL ，Taq酶0.2 μL，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R各0.8 μL，熒光探針DFV-P 為0.8 μL，去離子水補(bǔ)齊。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品（病毒含量為103.7～10-2.3 ELD50）為檢測(cè)模板，得到動(dòng)力學(xué)曲線圖1和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2。如圖1所示，橫坐標(biāo)代表循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度，圖中平行橫坐標(biāo)的直線代表熒光閥值，曲線①～⑦分別是7個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品的動(dòng)力學(xué)曲線；圖2為標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋進(jìn)行熒光定量結(jié)果的數(shù)據(jù)經(jīng)分析后自動(dòng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=-4.280 9x+33.788，R2≈0.99。從圖1可知，建立的熒光定量PCR檢測(cè)的最低病毒含量為10-0.3 ELD50，即10-4稀釋度。由圖2可知，模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3 特異性及與常規(guī)PCR敏感性比較

經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，鴨黃病毒HBJL株均顯示出良好的擴(kuò)增反應(yīng)曲線，分析結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。與常規(guī)PCR比較，熒光定量PCR方法能檢測(cè)到10-4稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，而常規(guī)PCR只能檢測(cè)到10-2稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品（圖3），結(jié)果表明，熒光定量PCR的敏感性是常規(guī)PCR的100倍左右。

特異性試驗(yàn)中鴨黃病毒HBJL株呈典型擴(kuò)增曲線，而其他禽流感、禽白血病、禽大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、鴨疫里默氏桿菌、新城疫、減蛋綜合征均為陰性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取3份不同病毒水平的鴨黃病毒樣品進(jìn)行組間重復(fù)性檢測(cè)（表1），由表1可知，重復(fù)性檢測(cè)的組間變異系數(shù)（CV）分別為4.4%、4.8%、3.7%，均小于5%，證明該檢測(cè)方法具有很好的重復(fù)性。

2.5 人工感染鴨胚的檢測(cè)

用本研究建立的熒光定量PCR方法從接種的30枚鴨胚中能檢測(cè)到鴨黃病毒。而常規(guī)PCR僅能從死亡的21枚鴨胚中檢測(cè)到陽(yáng)性。結(jié)果表明熒光定量PCR的敏感性明顯高出常規(guī)PCR。

3 討論

鴨黃病毒最早于2010年在中國(guó)浙江、福建、江蘇等地種鴨、蛋鴨場(chǎng)大范圍流行，該病的發(fā)生引起國(guó)內(nèi)禽病工作者的高度關(guān)注，曹貞貞等[2]最先對(duì)該病進(jìn)行了報(bào)道，將其稱(chēng)為鴨出血性卵巢炎，與此同時(shí)，騰巧泱等[3]也成功從華東地區(qū)爆發(fā)的疫情分離到該病的病原。通過(guò)一系列的研究已證實(shí)，該病原是一種與坦布蘇病毒親緣關(guān)系非常密切的黃病毒。黃病毒為黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒[4]。在相關(guān)的報(bào)道中，以感染人和其他哺乳動(dòng)物為主，如乙型腦炎病毒、登革熱病毒、豬瘟病毒等。但在2010年，中國(guó)首次突發(fā)大面積因該病原感染而造成的蛋鴨產(chǎn)蛋下降甚至死亡的疫情，給全國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，由于沒(méi)有相應(yīng)的技術(shù)儲(chǔ)備和特異性生物制品[5]，使得疫情得不到及時(shí)地確診和控制。

針對(duì)該病原的檢測(cè)還沒(méi)有一個(gè)很好的方法，本研究建立了一步法熒光定量PCR診斷方法。熒光定量PCR方法是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸的技術(shù)，是在普通PCR的基礎(chǔ)上增加了一條具有高特異性的熒光標(biāo)記DNA探針，通過(guò)始點(diǎn)定量和熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)的[6]。是目前國(guó)際上用在病毒檢測(cè)上最先進(jìn)的檢測(cè)方法之一，綜合PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)等于一體，具有很高的檢測(cè)靈敏度[7]；靶序列由引物和探針雙重控制，特異性高，與普通PCR擴(kuò)增技術(shù)相比具有無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。本研究針對(duì)鴨黃病毒的特異性序列進(jìn)行比對(duì)分析設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和一條特異TaqMan探針，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一種檢測(cè)鴨黃病毒的熒光定量PCR方法，其敏感度是常規(guī)PCR的100倍左右，可對(duì)大批量可疑樣品在2 h內(nèi)做出定性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果直接讀出，PCR污染的機(jī)率大大降低。為鴨黃病毒致病機(jī)理、診斷防治等基礎(chǔ)研究提供有效的手段。

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