一株鴿源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定

摘要：從武漢某地拾到一只死亡的信鴿，剖檢觀察其病變疑似鴿壞死性腸炎，從其腸內(nèi)容物中分離到1株細菌，對分離菌株進行形態(tài)觀察、生化試驗、細菌外膜蛋白基因的聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增的基因型鑒定及動物試驗等，結(jié)果鑒定該分離菌株為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）。

關(guān)鍵詞：鴿產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）；分離；鑒定

中圖分類號：S852.61+6.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5808-03

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）又稱魏氏梭菌（Clostridium welchii），廣泛存在于自然界的土壤、水源、人及動物腸道中，是導(dǎo)致人和多種動物疾病的人獸共患病原菌，嚴重威脅動物及人類公共衛(wèi)生安全。Welchii和Nutall于1892年首先從一具腐敗的人類尸體中分離得到該菌，并命名為魏氏梭菌，之后世界各地均有各種動物感染該菌發(fā)病的報道[1-3]。產(chǎn)氣莢膜梭菌通過產(chǎn)生多種外毒素致病，其中α、β、γ、δ是主要的致死毒素，按其所產(chǎn)生的毒素分為5種基因型，其中A型菌產(chǎn)生α毒素，C型菌產(chǎn)生α、β毒素。禽類感染A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可導(dǎo)致壞死性腸炎，造成嚴重損失[1-3]，因此對該菌的分離鑒定和基因分型，對禽類壞死性腸炎的防治研究具有重要意義。

2013年3月從武漢某地拾到一只死亡的信鴿，剖檢觀察其小腸腸管擴張充氣、出血嚴重，糞便呈暗綠色，疑似鴿壞死性腸炎病變，遂取其小腸后段內(nèi)容物接種于CW瓊脂培養(yǎng)基，從中分離到1株細菌，經(jīng)鑒定為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來源：2013年3月于武漢某地拾到的一只死亡的成年信鴿。

培養(yǎng)基：CW瓊脂基礎(chǔ)（含卡那霉素）、50%卵黃鹽水懸液購自青島日水生物技術(shù)有限公司；含卡那霉素+卵黃的CW瓊脂培養(yǎng)基按使用說明書自制。厭氣肉肝湯、肉肝胃酶消化湯按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》[4]自制。

參考菌株：A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C57-12株）、C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C59-37株）凍干菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室分離保存。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定

1）細菌的分離培養(yǎng)。無菌取死鴿小腸后段內(nèi)容物劃線接種于CW瓊脂培養(yǎng)基，42 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取單個疑似菌落純化培養(yǎng)，取純培養(yǎng)物接種于厭氣肉肝湯，42 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，做進一步鑒定。

2）紫牛乳鑒定。取分離菌的厭氣肉肝湯培養(yǎng)物接種于紫牛乳微量生化反應(yīng)管中，42 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，觀察是否出現(xiàn)爆裂發(fā)酵現(xiàn)象。

3）細菌形態(tài)觀察。挑取分離菌純培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

4）細菌生化試驗。取分離菌的厭氣肉肝湯培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、明膠、H2S、硝酸鹽、吲哚微量生化反應(yīng)管，42 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。硝酸鹽生化反應(yīng)管加入硝酸鹽還原試劑甲、乙各1滴，吲哚生化反應(yīng)管加入靛基質(zhì)試劑1滴，明膠反應(yīng)管培養(yǎng)48 h，放入4 ℃冰箱30 min，觀察結(jié)果。

1.2.2 細菌的基因型鑒定 采用PCR擴增分離菌株的α-毒素基因、β-毒素基因方法鑒定其基因型，具體參照文獻[5，6]的方法進行。

用煮沸法提取分離菌株及參考菌株的模板DNA。

反應(yīng)體系： 10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 1.0 μL（10 mmoL/L），上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），Taq DNA聚合酶2.5 U，模板10 μL，用雙蒸水補足至50 μL。

反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸l min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后于4 ℃保溫，結(jié)束反應(yīng)。

擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對擴增的基因片段進行測序分析，PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 動物試驗 將純化分離菌株接種于肉肝胃酶消化湯，42 ℃厭氧培養(yǎng)6 h，將菌液腹腔注射3只小鼠，0.3 mL/只，對照組3只小鼠注射等量生理鹽水，觀察24 h。解剖死鼠，腸內(nèi)容物涂片、染色、鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài) 疑似菌落在含卡那霉素+卵黃的CW瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、微隆起、卵黃色、表面褶皺、周圍形成白濁環(huán)、中等大小的菌落。

2.1.2 紫牛乳鑒定結(jié)果 分離菌的紫牛乳鑒定為陽性反應(yīng)，出現(xiàn)爆裂發(fā)酵現(xiàn)象。

2.1.3 細菌形態(tài) 在油鏡下觀察分離菌為革蘭氏陽性，菌體兩端鈍圓，粗桿狀，單個、成雙或者成短鏈狀存在。

2.1.4 細菌生化試驗結(jié)果 分離菌對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、明膠、H2S、硝酸鹽還原呈陽性反應(yīng)，對甘露醇、吲哚呈陰性反應(yīng)。

綜合上述試驗結(jié)果，分離菌的菌落形態(tài)、紫牛乳鑒定、細菌形態(tài)、生化試驗結(jié)果皆符合產(chǎn)氣莢膜梭菌特性，鑒定該分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.2 細菌的基因型鑒定結(jié)果

從分離菌中PCR擴增出α-毒素基因片段（長度402 bp）（圖1）及β-毒素基因片段（長度196 bp）（圖2），與預(yù)期擴增的基因片段大小一致?；蚱涡蛄袦y定結(jié)果與GenBank 中已發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌α-毒素基因、β-毒素基因序列同源性均達到99%。該產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因型鑒定為C型。

2.3 動物試驗結(jié)果

接種分離菌液后20 h內(nèi)，試驗組小鼠全部死亡，對照組小鼠全部存活。死鼠腸內(nèi)容物涂片、染色、鏡檢，可見與原培養(yǎng)物相同的革蘭氏陽性短粗桿菌。

3 小結(jié)與討論

剖檢死亡的信鴿可觀察到其小腸腸管充氣擴張，出血嚴重，糞便呈暗綠色，呈典型的壞死性腸炎病變。從腸道內(nèi)容物分離的細菌經(jīng)鑒定為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，動物試驗結(jié)果證實該信鴿因感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起壞死性腸炎導(dǎo)致死亡。

信鴿壞死性腸炎是鴿的多發(fā)疾病之一，死亡率約為2%。因此，對患壞死性腸炎病情嚴重的信鴿建議淘汰處理，鴿舍要徹底消毒；病鴿要隔離，可用敏感性抗生素治療；對健康信鴿減少應(yīng)激、控制飼料中能量及蛋白質(zhì)水平、在飼料中加入適量乳酸桿菌及維生素可有效預(yù)防該病的發(fā)生[7]。

參考文獻：

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[7] 吳衛(wèi)國.信鴿壞死性腸炎的診治[J].環(huán)球賽鴿科技，2004（5）：81.