豬卵巢采集月份、保存溫度及時(shí)間對其卵母細(xì)胞體外成熟的影響

摘要：為了探討豬卵巢采集月份、保存溫度及保存時(shí)間對卵母細(xì)胞體外成熟的影響，對不同月份、不同保存溫度及不同保存時(shí)間的豬卵巢采用抽吸法獲得卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），體外培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)其第一極體排出情況。結(jié)果表明，從屠宰場所取卵巢的COCs數(shù)5～7月和8～10月期間顯著（P<0.05）高于2～4月和11月至次年1月，而且其卵母細(xì)胞體外核成熟率在5～7月和8～10月期間也顯著（P<0.05）高于2～4月和11月至次年1月；采集的豬卵巢分別置于15、20、25、30和35 ℃的生理鹽水中2 h，收集卵巢的COCs數(shù)差異不顯著（P>0.05），但是存放在30和35 ℃的生理鹽水中的卵巢的卵母細(xì)胞體外成熟率極顯著（P<0.01）高于其他3組；置于35 ℃生理鹽水中2、4、6、8 h的卵巢的COCs數(shù)差異不顯著（P>0.05），但存放2 h的卵巢的卵母細(xì)胞體外成熟率顯著（P<0.05）高于存放4、6和8 h的。

關(guān)鍵詞：豬卵巢；卵母細(xì)胞；月份；溫度；時(shí)間；體外成熟

中圖分類號(hào)：S828.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5805-03

豬卵母細(xì)胞體外成熟（In vitro maturation，IVM）是體外受精技術(shù)（IVF）、胞漿單精子注射技術(shù)（ICSI）和克隆技術(shù)等成功與否的關(guān)鍵。近幾年，豬的卵母細(xì)胞體外成熟受到廣泛關(guān)注。為了解決豬胚胎體外生產(chǎn)中的兩個(gè)主要難題（細(xì)胞質(zhì)成熟不充分以及多精受精現(xiàn)象），人們首先將目光放在如何提高卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量上[1，2]。卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量對體細(xì)胞核移植成功率的影響巨大，目前進(jìn)行克隆豬和基因修飾豬研究所用的卵母細(xì)胞主要有兩種來源：體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞和體外成熟卵母細(xì)胞。應(yīng)用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量好，核移植后重構(gòu)胚發(fā)育潛能高；缺點(diǎn)是數(shù)量有限，獲取成本高昂。而體外成熟卵母細(xì)胞來自于屠宰場收集的卵巢，因此數(shù)量大，成本相對較低，但是其成熟質(zhì)量與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞有很大差距。

本試驗(yàn)對豬卵巢的采集月份、保存溫度、保存時(shí)間等因素對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響進(jìn)行了分析與探討，旨在為提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟的質(zhì)量及豬胚胎體外生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

DPBS購自Gibco公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（HCG），寧波激素制品廠；其他試劑如未特別注明，均購自Sigma公司。

1.2 溶液

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液為改良TCM199（mTCM199），添加3.05 mmol/L葡萄糖，0.91 mmol/L丙酮酸鈉，0.57 mmol/L L-半胱氨酸，1.00 mmol/L L-谷氨酰胺，10 ng/mL表皮生長因子（EGF），10 IU/mL HCG和10 IU/mL PMSG，75 μg/mL青霉素，50 μg/mL 硫酸鏈霉素，10%豬卵泡液（pFF）；洗卵液用DPBS；脫卵液用0.1%透明質(zhì)酸酶。

1.3 方法

1.3.1 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng) 豬卵巢從當(dāng)?shù)赝涝讏霾杉?，摘取新鮮卵巢立即置于盛有26～37 ℃生理鹽水（含160萬IU的青霉素和15萬IU的鏈霉素）的保溫瓶內(nèi)，2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，用適量生理鹽水（26～37 ℃）沖洗3～5次，盛于500 mL 燒杯中，放在水浴鍋（37 ℃）上。用鑷子夾取卵巢，再用生理鹽水潤濕滅菌紗布包裹，采用10 mL注射器（16號(hào)針頭）抽吸直徑為3～6 mm 的卵泡，吸取的卵泡液匯集到置于37 ℃水浴保溫的錐型滅菌試管中，抽完后靜置15～20 min，棄上清液，取試管底部卵泡液于表面皿中，實(shí)體顯微鏡下觀察，撿取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），轉(zhuǎn)移到DPBS 液滴中，沖洗3次，mTCM199 基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗3次，然后轉(zhuǎn)入盛有mTCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液的5孔板中。

1.3.2 豬卵泡液（pFF）的制備 抽取卵巢上3～6 mm 直徑的卵泡，將抽取的卵泡液放入離心管中離心（3 000 r/min）18 min，取上清液，于超凈工作臺(tái)內(nèi)以0.22 μm濾膜過濾后分裝于0.5 mL離心管中，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 卵母細(xì)胞成熟的觀察及鑒定 COCs培養(yǎng)44 h，在4×10倍實(shí)體顯微鏡下觀察卵丘細(xì)胞擴(kuò)散情況及胞質(zhì)發(fā)育是否均勻，然后將COCs轉(zhuǎn)移到0.1%透明質(zhì)酸酶溶液中，用移液器輕輕吹打脫去顆粒細(xì)胞，以第一極體排出作為卵母細(xì)胞成熟的主要指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用t檢驗(yàn)與方差分析對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢采集月份對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

本試驗(yàn)在不同的月份采集卵巢，并且對抽取的卵母細(xì)胞的成熟率進(jìn)行觀察，其結(jié)果見表1。由表1可見，5～7月和8～10月期間從屠宰場所取卵巢的COCs數(shù)量顯著高于2～4月和11月至次年1月（P<0.05），而且卵巢卵母細(xì)胞體外核成熟率在5～7月和8～10月期間也顯著高于2～4月和11月至次年1月。

2.2 卵巢保存溫度對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

由表2可見，將采集的豬卵巢分別置于15、20、25、30和35 ℃的生理鹽水中各2 h，收集到的卵巢的COCs數(shù)差異不顯著（P>0.05），但是存放于30和35 ℃的生理鹽水中，其卵母細(xì)胞的體外成熟率極顯著（P<0.01）高于其他3組。說明卵巢儲(chǔ)存溫度對豬卵母細(xì)胞體外成熟影響較大。

2.3 卵巢保存時(shí)間對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

將采集的豬卵巢分別置于35 ℃的生理鹽水中2、4、6、8 h，比較其COCs數(shù)及卵母細(xì)胞的體外成熟率，其結(jié)果見表3。由表3可見，不同存放時(shí)間下其COCs數(shù)差異不顯著（P>0.05），但存放2 h的卵巢其卵母細(xì)胞的體外成熟率與存放4、6和8 h相比差異顯著（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

3.1 卵巢采集月份對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

大部分屠宰場一年四季都在屠宰生豬，所以豬卵巢的供應(yīng)是不間斷的。然而在試驗(yàn)過程中常常會(huì)遇到不同的季節(jié)豬卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量有顯著的差別。本試驗(yàn)結(jié)果表明采集豬卵巢最適宜的月份為5～10月，其他季節(jié)采集的豬卵巢卵母細(xì)胞體外成熟率與這一季節(jié)相比差異顯著。研究表明季節(jié)變化引起的諸如環(huán)境溫度的冷熱應(yīng)激等可使母豬卵巢功能減退，受胎率降低，胚胎存活率下降，流產(chǎn)增加[3，4]。屠宰場初情期前母豬來自不同的養(yǎng)殖場，因此在四季轉(zhuǎn)變過程中光周期、不同養(yǎng)殖場飼料成分以及管理方式的不同等都會(huì)導(dǎo)致豬卵巢卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的差異[5]。特別在國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)整體科技含量還不高的背景下，畜舍夏季的防暑降溫和冬季的保暖工作還不是很完善，其惡劣的環(huán)境極易影響即將出欄的初情期前母豬的繁殖力，進(jìn)而造成其卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的差異。這可能是生物自身調(diào)節(jié)從而有利于生殖的一種方式。試驗(yàn)結(jié)果表明季節(jié)變化對豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力有較大影響。

3.2 卵巢保存溫度對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

大量的研究結(jié)果表明，卵巢不同保存溫度對豬卵母細(xì)胞的體外成熟有很大影響。First等[6]報(bào)道，當(dāng)卵巢的貯存溫度低于30 ℃時(shí)，會(huì)對卵母細(xì)胞的成熟和隨后的胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利的影響。邢鳳英等[7]也報(bào)道，分別在22.0、30.0、37.0、38.5、40.0 ℃下保存卵巢，隨著溫度的升高，其卵母細(xì)胞體外成熟后的質(zhì)量、激活后的卵裂率和囊胚率均明顯下降，當(dāng)達(dá)到40.0 ℃時(shí)成熟培養(yǎng)后卵子的死亡率明顯增加，激活后卵裂的形態(tài)異常率明顯增加，細(xì)胞質(zhì)不均勻，碎裂率升高，不能發(fā)育到囊胚，認(rèn)為37 ℃的生理鹽水保存豬卵巢效果最佳。以上報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，豬卵巢保存溫度在30～35 ℃時(shí)其卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率最高，而低于20 ℃時(shí)其卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率顯著下降。但也有研究[8，9]表明，豬卵巢在4 ℃放置12～24 h后其卵裂率不受明顯影響。從常理上講，應(yīng)該是保存溫度降低得越少越好，但有時(shí)結(jié)果并不是這樣，其原因可能是豬接近排卵時(shí)卵泡內(nèi)溫度低于卵巢基質(zhì)溫度網(wǎng)，采用與豬卵母細(xì)胞體外成熟溫度一樣溫度的生理鹽水收集卵巢，對其卵巢內(nèi)卵泡卵母細(xì)胞有不良影響，當(dāng)采用和體外培養(yǎng)相同或更高溫度的生理鹽水保存卵巢時(shí)，卵子受到熱應(yīng)激而影響其成熟后的質(zhì)量。或者是因?yàn)樘鞖庠?，采集卵巢時(shí)生理鹽水溫度下降幅度較大，影響了豬卵母細(xì)胞的體外發(fā)育所致。

3.3 卵巢保存時(shí)間對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，從屠宰場獲取豬卵巢帶回實(shí)驗(yàn)室收集卵母細(xì)胞的時(shí)間以2 h之內(nèi)最好，最晚不超過6 h。豬卵巢置于35 ℃的生理鹽水中2 h，然后采集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，其卵母細(xì)胞的體外成熟率明顯高于其他各組。豬卵巢保存時(shí)間越長，其卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量越差。王峰[10]研究發(fā)現(xiàn)，牛的卵巢在24～25 ℃貯存8 h，其卵母細(xì)胞的成熟率無明顯下降。在生發(fā)泡階段分離的卵母細(xì)胞比卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞對冷刺激更加敏感，將生發(fā)泡期的卵母細(xì)胞在0 ℃處理30 min，只有1%的卵母細(xì)胞能夠發(fā)育到囊胚[11]，這可能是由于MⅡ期的紡錘體形成異常所致[12]。而在卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，由于卵泡內(nèi)環(huán)境的保護(hù)，可以使卵母細(xì)胞免受低溫的損傷，因而其發(fā)育能力沒有受到影響。保存在35 ℃的豬卵巢，會(huì)隨著保存時(shí)間的延長，卵泡液的pH降低，卵母細(xì)胞核DNA碎片化的比率升高，從而降低了卵母細(xì)胞的成熟能力[13]。

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