水溶性維生素檢測分析的研究進展

摘要：維生素是維持生命活動必不可少的一類有機化合物，攝入不足或過量均可導致機體功能障礙，因其易在烹調(diào)、加工過程中損失，因此分析和評價食品和營養(yǎng)保健品中的維生素含量將對指導人群科學攝取維生素具有重要參考價值。水溶性維生素多為強極性化合物，其檢測難度較大，因此系統(tǒng)介紹了微生物法、分光光度法、高效液相色譜法等水溶性維生素的檢測方法，并針對多種水溶性維生素聯(lián)合檢測的高效液相色譜法，從同時提取、分離以及檢測等方面進行綜述，以期為今后開展水溶性維生素的高通量快速分析提供借鑒和參考。

關(guān)鍵詞：水溶性維生素；聯(lián)合檢測；高效液相色譜法

中圖分類號：O657.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5676-05

維生素是一類人體不能合成或合成量不足、必須直接或間接從食品中攝取的化合物，廣泛存在于谷類、果蔬、肉禽及蛋類等動植物細胞中。根據(jù)其溶解性差異，分為水溶性維生素（Water-soluble vitamins，WSVs）和脂溶性維生素（Fat-soluble vitamins，F(xiàn)SVs）。WSVs通常指極性較大，易溶于水的一類維生素，包括B族維生素、生物素（H）和抗壞血酸（VC）等?，F(xiàn)已知WSVs具備多種生理生化功能。例如：B族維生素是多種輔酶的組成成分，參與有機體中的糖、脂肪、蛋白質(zhì)及核苷酸的合成代謝；VC作為強氧化劑參與了氨基酸羥化反應和去除自由基等過程。目前已建立了單一WSV的檢測方法[1-3]，現(xiàn)行分析方法（國標、歐盟指令條例和AOAC標準等）多數(shù)為微生物法、分光光度法，但這類方法耗時、費力，已難以滿足當前分析要求和發(fā)展趨勢?；谏V技術(shù)的分析方法準確、快速、重現(xiàn)性好等特點，目前已在WSVs上得到了應用，高通量WSVs檢測方法已有報道，但由于WSVs結(jié)構(gòu)各異，理化性質(zhì)差異大，導致建立高通量的維生素前處理和檢測方法難度較大，本研究將圍繞相關(guān)進展進行評述，以期為開展相關(guān)工作提供參考。

1 微生物法

1889年Beijerinck首次發(fā)現(xiàn)酵母菌的生長與其生長環(huán)境中的某些營養(yǎng)成分存在對應關(guān)系，由Williams首次提出微生物測定維生素的構(gòu)想，隨后B族維生素的微生物法相繼建立，并于20世紀50年代廣泛地應用于食物、藥劑和飼料等各類樣品的分析[4-6]。盡管早期微生物法是分析WSVs的標準方法，但是該方法檢測時間長、操作復雜，檢測結(jié)果的相對不確定度達到±20%，而且還存在培養(yǎng)污染、菌株個體差異、樣品基質(zhì)影響菌株生長等[7]不確定性因素，導致方法重現(xiàn)性較差?；谏鲜鲈?，目前微生物法在常規(guī)WSVs分析中已基本淘汰。

2 光度法

光度法（Spectrophotometry）是繼微生物法之后開發(fā)的一類方法，包括紫外分光光度法和分子熒光法等。這類方法一般是測定維生素或其衍生物在特定波長或激發(fā)光下的吸光度或發(fā)射光強度從而進行定性定量分析的一類方法。紫外分光光度法的操作簡單、快速、取樣量小、成本低、選擇性強，但吸光度值易受樣品基質(zhì)的干擾。分子熒光法的靈敏度通常比紫外分光光度法高2～4個數(shù)量級，因此檢出能力更強。例如，分子熒光法可用于VB1、VB2、VB6的聯(lián)合檢測，最小檢出濃度依次為12、9、10 μg/L[8]，但由于目標物結(jié)構(gòu)相似，熒光光譜重疊，存在干擾，其穩(wěn)定性和選擇性有待提高。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是根據(jù)化合物性質(zhì)差異，在固定相和流動相中反復分配，依次進入檢測器產(chǎn)生信號的一類方法。目前幾乎所有的WSVs均可采用HPLC法分析，檢出限最低可達ng水平。但由于WSVs理化性質(zhì)各異，盡管同時分析多種WSVs具有分析效率高、檢測成本低等優(yōu)點，但其難度較大?，F(xiàn)有多種WSVs分析方法詳見表1。需要指出的是，WSVs的同時檢出方法受到前處理、色譜條件和檢測器等因素影響極大，現(xiàn)簡述如下。

3.1 提取方法

提取方法直接決定HPLC法檢測的靈敏度和準確度。由于WSVs極性較大，這使得采用極性較大的試劑同時提取多WSVs成為可能。由于WSVs存在游離態(tài)或者結(jié)合態(tài)兩種，因此WSVs的同時提取根據(jù)樣品不同略有差異。游離態(tài)WSVs通常采用水提取，而對于嬰兒營養(yǎng)配方食品或維生素強化飲料等復雜樣品，通常先用醋酸鋅或高氯酸等試劑先沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，然后采用乙酸銨-甲醇或者乙酸-水溶液提??；結(jié)合態(tài)WSVs通常被基質(zhì)中的蛋白質(zhì)或糖等化合物偶聯(lián)或包裹[9]，因此在提取前常需采用硫酸、鹽酸或蛋白酶、淀粉酶水解樣品，將結(jié)合態(tài)的WSV轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的WSV，并結(jié)合固相萃取凈化，獲得待測液[10，11]。例如天然食品中的VB2主要以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在。因此，分析VB2時通常采用先水解再酶解的方法將其轉(zhuǎn)化為游離態(tài)VB2后再分析；檢測樣品中VB6總量時，將磷酸化和游離狀態(tài)的類維生素（吡哆醛、吡哆酮）轉(zhuǎn)化為吡哆醇[12]。但不管是酸水解還是酶水解，效率均較低，且WSVs多以輔基、輔酶形式存在，酸消化雖然能釋放出部分維生素的游離形式，但易損壞某些種類的結(jié)構(gòu)，比如葉酸在酸性溶液中對熱不穩(wěn)定，泛酸雖在pH 5～7的水溶液中最穩(wěn)定，但遇酸或堿則水解，因此酸解并不適合于多種WSVs的聯(lián)合檢測。

超聲處理屬于物理前處理方法，在高頻聲波（>20 kHz）作用下，在液體中可產(chǎn)生強化傳質(zhì)、空化以及發(fā)熱等多種效應，不僅有助于樣品分散，更有助于樣品中的WSVs進入提取液。目前，超聲處理的方法已廣泛應用于藥物檢驗，并列入《中國藥典》中VC、VB1以及VB2的前處理方法[22]。而近10年，恒溫（低溫）超聲的方法也總被用于WSVs的提?。ū?）。另外，在前處理中，為避免部分WSVs發(fā)生氧化反應，常在提取過程中使用抗氧化劑，包括丁羥甲苯、硫代硫酸鈉、EDTA等[13]。并在操作過程中要盡量避光，降低WSVs的光解率。

3.2 液相色譜分析

由于WSVs極性較強，使得開發(fā)多種WSVs同時分離的方法難度較大。目前報道的WSVs液相色譜分析方法主要包括3類：化學鍵合相色譜、離子交換色譜和親水作用色譜等。

3.2.1 化學鍵合相色譜 WSVs的聯(lián)合檢測多采用C18鍵合固定相色譜分析，這類方法通常選擇甲醇、乙腈等有機試劑和緩沖劑（如乙酸、磷酸二氫銨等）為流動相，梯度洗脫，其重復性好，不僅適合于WSVs的多組分檢測，還特別適宜于WSVs和FSVs的聯(lián)合檢測。我國食品安全國家標準《嬰幼兒食品和乳品中維生素B6的測定》中采用C18柱實現(xiàn)3種VB6（吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺）的分離[12]。Heudi等[23]運用C18柱分離、以酸性乙腈梯度洗脫、紫外雙波長（210 nm和275 nm）檢測，定量分析了嬰兒強化食品中的9種WSVs。Borivoj等[24]采用C18柱，以0.010%三氟乙酸-甲醇梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測實現(xiàn)了樣品中的10種WSVs和4種FSVs的同時檢出。但另一方面，由于WSVs含有極性基團，溶液中常以離子形式存在，如VB1和VB6，因此采用反相色譜分析樣品中的WSVs時，某些WSVs的保留時間短，甚至不保留。為此，常采用含離子對試劑的流動相，通過離子對試劑中和WSVs的電荷，形成配對離子[25]，Vidovic等[26]以0.012 5 mol/L己烷磺酸鈉為離子對試劑，采用C18柱成功分離了VC、VB1、VB2、VB3、VB5和VB6，但這類方法的平衡時間較長，特別是長期使用離子對試劑易對C18柱產(chǎn)生損傷，因此，也有采用離子交換色譜分析WSVs。

3.2.2 離子交換色譜 離子交換色譜根據(jù)固定相中帶電基團不同分為陽離子和陰離子2種，可與溶液中的陽離子或陰離子發(fā)生交換。在采用離子交換色譜分析WSVs時，常通過調(diào)節(jié)流動相pH來控制WSVs帶電狀態(tài)，進而分離各種WSVs。2011年，Dabre等[19]運用反相弱陰離子交換（Reversed-phase weak anion exchang，RP-WAX）樹脂為固定相，磷酸鹽緩沖液/乙腈梯度洗脫，同時檢測了維他命含片中的7種WSVs和3種FSVs，WSVs的檢出限為0.335～6.719 μg/mL。離子交換色譜分析WSVs的關(guān)鍵在于調(diào)節(jié)流動相pH，存在一定難度，因而該方法并不普及。

3.2.3 親水色譜 親水作用色譜（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）是用來改善在反向色譜中強極性化合物保留行為差的一種色譜方法[27]，主要特征在于親水性的固定相，流動相通常是含高比例有機溶劑的水溶液和與有機試劑相容性好的緩沖液組成，因而可避免水溶性物質(zhì)不溶于RP-HPLC流動相的問題。由于流動相的特點，檢測器適合選擇質(zhì)譜檢測器（MS）或蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）。在分析親水化合物時，HILIC的檢測靈敏度通常會比RP-HPLC提高10～1 000倍。Goldschmidt等[21]同時比較了3種色譜柱（2種普通C18柱和1種HILIC柱），發(fā)現(xiàn)HILIC對VB1、VB6、煙酰胺3種WSVs的分離效果好，信號強度比反相色譜大，但對葉酸、生物素、VB2、泛酸無明顯優(yōu)勢。Yang等[28]研究了親水色譜柱的選擇（純硅膠柱、酰基柱、氨基柱）與流動相條件（pH值、流動相比例等）對HILIC-ESI-MS檢測WSVs的影響，發(fā)現(xiàn)在pH 2～8范圍內(nèi)，中性和弱極性（尼克酰胺和氨基苯甲酸）的WSVs在HILIC上基本無保留，而酸性維生素（尼克酸和葉酸）和堿性維生素（硫胺素和吡哆醇）在色譜柱上均有保留，且保留特性不同。

3.3 檢測器

根據(jù)WSVs的結(jié)構(gòu)特征，目前在液相色譜中采用的檢測器主要包括：紫外/二極管陣列檢測器（Ultraviolet/Diode array detector，UV/DAD）、熒光檢測器（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）、質(zhì)譜檢測器（Mass detector，MS）等。由于多種WSVs中具有生色團（羧基、醛基、共軛雙鍵等），因此紫外檢測器適宜于幾乎目前已知的全部WSVs，而且，檢測器分析成本低，操作簡單，也是目前使用最為廣泛的檢測器[29，30]；同時，選擇離子對試劑，可增加保留時間，優(yōu)化部分維生素的峰形[31]。而采用DAD檢測器還可獲得色譜峰的紫外-可見光譜，因此可以通過色譜峰保留時間和光譜圖實現(xiàn)雙參數(shù)定性，最大程度避免假陽性結(jié)果。對于痕量WSVs而言，該UV/DAD已經(jīng)不適合這類維生素的檢測。對于這類WSVs，采用FLD或者MS檢測器，能提高檢測的靈敏度。目前，主要有兩類維生素可通過FLD分析：其一，自然產(chǎn)生熒光的，如VB6和VB2可以無需衍生直接檢測[32]，其二，不能產(chǎn)生熒光的WSVs需要衍生或其他化學修飾，如VB1在堿性介質(zhì)中被鐵氰化鉀氧化發(fā)生藍色的熒光，采用FLD檢測，定量限為0.05 mg/100 g[1]；在分析VB5時，采用柱后衍生將VB5衍生合成熒光化合物，檢出限達0.65 μg/g[33]。但是，由于不同WSVs的處理過程往往不能統(tǒng)一，F(xiàn)LD常用于同時分析具備天然熒光特征的WSVs；并且，由于儀器的限制，很難同時設(shè)置多組激發(fā)波長與發(fā)射波長來測定WSVs。因而，F(xiàn)LD并不普遍用于WSVs的聯(lián)合檢出。

采用MS檢測器（Mass spectrometry，MS）分析WSVs，是近幾年報道的一類檢測方法。質(zhì)譜分析，特別是串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用可檢測多種基質(zhì)中的WSVs含量[14，34-36]，具有更高的特異性和靈敏度。王一紅等[37]采用反相液相色譜分離10種水溶性維生素，用電噴霧正離子源進行離子化，選擇反應監(jiān)測方式（SRM）進行監(jiān)測，三重四極桿質(zhì)譜測定，檢出限達0.1～0.8 ng/L。Zand等[14]采用LC-MS分析嬰幼兒食品中的VB2、VB6，檢出限達0.07 μg/mL。MS在分析不含生色基團的維生素時有明顯優(yōu)勢，并且無需加入對色譜柱有影響的離子對試劑，但是由于串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)復雜，維護成本高，因而該方法尚未普遍用于WSVs的分析。

4 小結(jié)

相較于傳統(tǒng)的微生物法、分光光度法，HPLC法在檢測單一或多種WSVs時都更加快捷、靈敏、準確。隨著分析化學技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外各食品、藥品檢測標準都傾向于選擇HPLC法，但僅涉及單一WSVs的檢出，聯(lián)合檢出方法還在實驗室摸索階段。近10年來，隨著許多靈敏、高效的HPLC聯(lián)合檢出方法不斷產(chǎn)生，建立準確、快速的WSVs聯(lián)合檢測技術(shù)、并制定相關(guān)標準，不僅有助于評價相關(guān)食品、保健品的營養(yǎng)指標，也與日益發(fā)展的食品、藥品加工技術(shù)相配套，為科學、合理地服用維生素制品提供參考。

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