HPLC法測(cè)定嗎氯貝胺片的有關(guān)物質(zhì)

【摘 要】目的：建立高效液相色譜測(cè)定嗎氯貝胺片片有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用C18柱（250mm×4.6mm），以甲醇-水（40：60）為流動(dòng)相，用冰乙酸調(diào)pH值到2.6，流速0.3ml·min-1，滴加2滴三乙酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm，自身對(duì)照法測(cè)定。結(jié)果：線性范圍為2.5～80μg·ml-1，R2=0.9978，最低檢測(cè)限為3.0ng。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，可以用于嗎氯貝胺片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 嗎氯貝胺片；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜儀

【中圖分類號(hào)】 R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 B

Determination of Related Substances in Moclobemide Tablets by HPLC

Li Xuekun Peng Hongmei Han Houliang

（Pharmaceutical Co.， Ltd. Shandong Luoxin，Linyi，Shandong， 276017）

【Abstract】 Objective： To establish an HPLC method for the determination of related substances in Moclobemide Tablets. Methods： The separation was performed on C18 Column with mobile phase consisted of Ethanol -water （40：60），the pH of liquid was adjusted to 2.6 with glacial acetic acid，add 2d triethylamine； and the flow rate was 0.3mL·min- 1. The detection wave length was set at 240nm. The content of related substance was calculated by self-control with main component.Results： The standard curve was linear within the range of 2.5～80μg·ml-1 （R2=0.9978） and the limit of detection was3.0ng.Conclusion： The method is accurate and simple for the determination of the related substances in Moclobemide Tablets.

【Keywords】 Moclobemide Tablets； related substances； HPLC

嗎氯貝胺化學(xué)[1]名為4-氯-N-[2-（4-嗎啉基）-乙基]-苯酰胺，為新型抗抑郁藥。已有采用高效液相色譜法測(cè)定血藥濃度的報(bào)道[2-4]，但操作繁瑣，所用儀器及費(fèi)用昂貴。本文為了對(duì)嗎氯貝胺進(jìn)行更好的質(zhì)量控制，采用了高效液相色譜（HPLC）的主成分自身對(duì)照法檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫公司），C18色譜柱（SHIMADZU），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。嗎氯貝胺對(duì)照品；嗎氯貝胺片（批號(hào)20110301，20110302，

20110303），規(guī)格：1mg/片，由魯南制藥提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

2.1.1 色譜條件以及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 選擇填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為甲醇-水-三乙胺（30：69.5：0.5），選擇0.3mL·min-1為流速， 25 ℃為柱溫，選擇240nm作為檢測(cè)的波長(zhǎng)。以嗎氯貝胺峰計(jì)算理論板數(shù)，應(yīng)≥2000。

2.1.2 供試品與對(duì)照品溶液的制備 精密稱取約等于嗎氯貝胺10mg的細(xì)粉，放于50ml的容量瓶中，加甲醇-水-三乙胺溶解，搖勻后過(guò)濾，供試品溶液用濾液；置1.0毫升的供試液于100毫升的容量瓶中，加甲醇-水-三乙胺溶液稀釋到刻度后，做對(duì)照品溶液。

2.1.3 測(cè)定方法 在液相色譜儀中注入10μL對(duì)照品溶液，調(diào)節(jié)儀器設(shè)置，使?jié)M量程的20%為主要成分的峰高；再在液相色譜儀中注入10μL供試溶液，記錄色譜圖，使其為主成分峰的保留時(shí)間的兩倍。供試液如果出現(xiàn)了雜質(zhì)峰，將輔料峰和溶劑峰刪除，單雜峰面積≤對(duì)照品主峰面積的0.5%，總雜峰面積≤對(duì)照品的主峰面積的1.0%。

2.2 專屬性的考察 取空白輔料（約等于嗎氯貝胺10mg），配制供示液，進(jìn)行液相測(cè)定，如圖A。結(jié)果表明空白輔料不干涉有關(guān)物質(zhì)檢查。

2.3 檢測(cè)限 逐漸稀釋對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)量最低為3.0ng。

2.4 降解物的檢查

2.4.1 高溫破壞試驗(yàn) 將本品置于105℃的溫度下，加熱兩個(gè)小時(shí)后冷卻，稱取一定的量，加入甲醇-水-三乙胺溶解，制成約含2 毫克/毫升的溶液，過(guò)濾后去濾液。在液相色譜儀中注入10μl濾液，記錄液相色譜圖，如圖D。結(jié)果表明，上述條件下樣品，新增2個(gè)雜質(zhì)峰，雜質(zhì)峰與主峰及各雜質(zhì)峰之間有效分離。

2.4.2 酸破壞試驗(yàn) 取約等于10mg嗎氯貝胺的細(xì)粉，放于燒杯中，加5ml 2摩爾/升的HCL溶液，60℃水浴加熱30min，加2mol/L氫氧化鈉溶液中和剩余鹽酸，放冷，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，加甲醇-水-三乙胺溶解，稀釋到刻度后搖勻，在液相色譜儀中注入10μl濾液，記錄液相色譜圖，見(jiàn)圖E。結(jié)果表明，上述條件下樣品，新增3個(gè)雜質(zhì)峰，雜質(zhì)峰與主峰有效分離。

2.4.3 堿破壞性實(shí)驗(yàn) 取約等于10mg嗎氯貝胺的細(xì)粉放于燒杯中，加5ml 2摩爾/升的NaOH溶液，60℃加熱約30min，用2摩爾/升的鹽酸溶液去中和剩余的氫氧化鈉，放冷，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，加甲醇-水-三乙胺溶解，稀釋到刻度后搖勻，在液相色譜儀中注入10μl的濾液，記錄液相色譜圖，見(jiàn)圖F。結(jié)果表明，上述條件下樣品，新增4個(gè)雜質(zhì)峰，雜質(zhì)峰與主峰、各雜質(zhì)峰之間有效分離。

2.4.4 氧化破壞性實(shí)驗(yàn) 取約等于10mg嗎氯貝胺的細(xì)粉放于10ml的量瓶中，加30%H2O22ml，60℃水浴加熱30分鐘，加甲醇-水-三乙胺溶解，稀釋到刻度后搖勻，在液相色譜儀中注入10μl濾液，記錄液相色譜圖，見(jiàn)圖G。結(jié)果表明，上述條件下樣品，新增4個(gè)雜質(zhì)峰，雜質(zhì)峰與主峰、各雜質(zhì)峰之間有效分離。

2.4.5 光破壞試驗(yàn) 取本品，置4500Lx的澄明度檢測(cè)儀下光照24h，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于10mg嗎氯貝胺的細(xì)粉，放于燒杯中，溶解后倒入50ml的量瓶里，加甲醇-水-三乙胺溶解，稀釋到刻度后搖勻，在液相色譜儀中注入10μl的濾液，記錄液相色譜圖，見(jiàn)圖H。結(jié)果表明，上述條件下樣品新增4個(gè)雜質(zhì)峰，雜質(zhì)峰與主峰、各雜質(zhì)峰之間有效分離。

劇烈條件實(shí)驗(yàn)表明，樣品在高溫、酸條件下較穩(wěn)定，在堿、氧化劑和光照條件存在下不穩(wěn)定，提示樣品貯存應(yīng)盡量避免酸和氧化劑。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 在一定的條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次供試液，計(jì)算得色譜圖中峰面積的RSD%為0.23%，說(shuō)明本法具有較好的精密度。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性 用甲醇-水-三乙胺配制的對(duì)照品系列溶液（濃度為μg·mL-1）10μL進(jìn)行進(jìn)樣。以Y對(duì)C進(jìn)行線性回歸：A = 59281+ 82166422C，r=0.998線性范圍為2.5～80μg·ml-1（n=8，R2=0.9986）。表明對(duì)照品的線性關(guān)系在2.5～80μg·mL-1范圍內(nèi)較好。

2.7 供試液的穩(wěn)定性考察 取10μL對(duì)照液，在0，2，4，6和8 h時(shí)注入到液相色譜儀中，結(jié)果計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的平均含量為98.3%，表明在8h內(nèi)測(cè)定液基本上穩(wěn)定。

2.8 樣品的測(cè)定和雜質(zhì)的總量計(jì)算 采用主成分自身對(duì)照法計(jì)算樣品的雜質(zhì)總量。將對(duì)照液的主成分峰面積和測(cè)量供試液的液相色譜圖的總雜進(jìn)行比較，計(jì)算出雜質(zhì)的含量，單雜≤0.5%，總雜≤1.0%，見(jiàn)圖A，B。3批樣品（20110301，20110302，

20110303），雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 分離條件選擇 試驗(yàn)中考察了兩種組成的流動(dòng)相：甲醇-緩沖液（取水500ml，加磷酸3ml，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.6）（40：60）（為國(guó)標(biāo)中原料藥有關(guān)物質(zhì)測(cè)定和片劑含量測(cè)定所采用的流動(dòng)相[5]）和甲醇-水（用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至2.6）（40：60），對(duì)同一份加速破壞實(shí)驗(yàn)的供試液進(jìn)樣，變換甲醇-水-三乙胺的比例從而改變各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間，比較流動(dòng)相調(diào)整前后雜質(zhì)峰的個(gè)數(shù)和分離情況，分別考察了熱破壞、光破壞、酸、堿破壞和氧化劑破壞的樣品，結(jié)果表明：前者有溶劑峰干擾，雜質(zhì)峰分離不完全，后者無(wú)明顯溶劑峰，雜質(zhì)峰和主峰、雜質(zhì)峰之間分離較理想，故選擇甲醇-水（用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至2.6）（40：60）為流動(dòng)相進(jìn)行分離。

同時(shí)，嗎氯貝胺結(jié)構(gòu)中含有氮雜環(huán)，造成拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道[ 6，7]，在流動(dòng)相中加入0.1%的三乙胺可以改善峰型的對(duì)稱型。嗎氯貝胺及內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間隨流動(dòng)相pH的降低而縮短，內(nèi)標(biāo)物對(duì)流動(dòng)相pH的色譜行為敏感性強(qiáng)嗎氯貝胺，為達(dá)到合適的分離效果和保留時(shí)間，本試驗(yàn)的流動(dòng)相pH 定為2.6。在參照國(guó)外文獻(xiàn)方法時(shí)[8]，采用磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相中的水相（ pH= 3.9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸鹽類在泵體和管路內(nèi)易析出晶體而造成阻塞，不僅影響了色譜柱的使用壽命，且該條件下嗎氯貝胺的檢測(cè)靈敏度、分離度易低。由于嗎氯貝胺是含有氨基的堿性有機(jī)物，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程在去除流動(dòng)相中磷酸鹽成分的基礎(chǔ)上，加入胺類修飾劑三乙胺，從而改變嗎氯貝胺與固定相的離子交換作用，并克服親硅醇基效應(yīng)，可調(diào)節(jié)保留時(shí)間和減少拖尾.因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程選用的流動(dòng)相為甲醇-水（40：60），同時(shí)加入0.1%的三乙胺，并用冰乙酸調(diào)PH至2.6。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中流速參考以前報(bào)道[1，5，6，9]為1.0，但由于實(shí)驗(yàn)條件的色譜柱的限制，需要不斷調(diào)整流速，使最大壓力不超過(guò)15Mpa，通過(guò)調(diào)整，確定為0.3時(shí)比較合適。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇 將供試液在波長(zhǎng)195，210，240，274，310，

365nm處測(cè)定，通過(guò)粗略估算相對(duì)響應(yīng)因子（f）（降解物對(duì)主成分的），對(duì)比實(shí)驗(yàn)前后的主峰個(gè)數(shù)以及面積的變化，結(jié)果：在240nm波長(zhǎng)處測(cè)得的雜質(zhì)峰最多， 0.8

3.3 測(cè)試樣品濃度的確定 實(shí)驗(yàn)得出樣品的最大載樣濃度≤1mg·ml-1（進(jìn)樣10μL），否則就會(huì)對(duì)各組分的分離度產(chǎn)生影響，定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果：11×10-6 mg·ml-1為最低的定量濃度（按信噪比10：1計(jì)），因此選擇0.2mg·ml-1作為樣品的測(cè)試濃度。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)限的規(guī)定 原料藥的標(biāo)準(zhǔn)為單雜≤0.5%，總雜≤1.0%，另取五批片劑于24個(gè)月時(shí)測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，均滿足單雜≤0.5%，總雜≤1.0%。因此，建議將片劑的有關(guān)物質(zhì)限度確定為單雜≤0.5%，總雜≤1.0%。

4 結(jié)論

專屬性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明此法的專屬性好，靈敏度高，重復(fù)性好，最低檢測(cè)限等均適合嗎氯貝胺片的質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究。

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