黃連提取物抗細(xì)菌內(nèi)毒素作用

【摘 要】目的：探討黃連提取物影響細(xì)菌內(nèi)毒素的作用。方法：以細(xì)菌內(nèi)毒素為致熱原，觀察三種不同劑量（0.10g/kg，0.08g/kg，0.06g/kg）的黃連提取物對(duì)內(nèi)毒素所致家兔發(fā)熱的影響；另外，以2EU/ml的內(nèi)毒素溶液給小鼠腹腔注射，觀察三組不同劑量的黃連提取物對(duì)內(nèi)毒素所致小鼠死亡的保護(hù)作用。結(jié)果：黃連提取物三個(gè)劑量組的家兔平均體溫變化要明顯低于空白組；與空白組相比，黃連提取物三個(gè)劑量組的小鼠死亡率均明顯降低，且小鼠的平均死亡時(shí)間均明顯延長(zhǎng)。結(jié)論：黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素導(dǎo)致家兔發(fā)熱有明顯的解熱作用；對(duì)2EU/ml的內(nèi)毒素所致小鼠死亡有較好的保護(hù)作用，并可明顯延長(zhǎng)小鼠的死亡時(shí)間。

【關(guān)鍵詞】 黃連提取物；抗細(xì)菌內(nèi)毒素

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 B

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinernsis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功能。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，黃連的活性作用主要與其根莖所含的生物堿（約占根莖的4%～8%）有關(guān)，包括小檗堿（berberine）、黃連堿（coptisine），甲基黃連堿（worenine）、巴馬亭（palmatine）、藥根堿（jatrorrhizine）、表小檗堿（epiberberine）、木蘭花堿（mognoflorine），及中藥炮制過(guò)程中由小檗堿轉(zhuǎn)化而來(lái)的9-去甲小檗堿（berberrubine）等。黃連的主要活性成分是小檗堿，以鹽酸鹽的形式存在于黃連中，是一種異喹啉類(lèi)生物堿，它具有抗菌，抗炎及抗腹瀉作用.千百年來(lái)它一直被廣泛用于治療皮膚炎癥，肝炎，腹瀉及其它炎癥[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，同只用抗生素相比，小檗堿和抗生素聯(lián)用能明顯提高抑菌活性[3-4]。然而，黃連提取出的生物堿抗菌消炎機(jī)制尚不明確，其治療感染性疾病的機(jī)制可能是其通過(guò)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的活性從而發(fā)揮抗炎作用的。

內(nèi)毒素（endotoxin）是革蘭式陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要組成成分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），是誘發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)程中主要的致病成分[5]。脂多糖是由一個(gè)具有疏水性表面的錨Lipid A，一個(gè)核內(nèi)寡糖，以及一個(gè)復(fù)合-O-抗原多糖組成的[6]。內(nèi)毒素感染可導(dǎo)致炎癥發(fā)生，從而引起嘔吐，發(fā)熱，腹瀉，白細(xì)胞數(shù)目減少，及高血壓等癥狀。

在本研究中，通過(guò)觀察黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素導(dǎo)致的家兔發(fā)熱及小鼠死亡的影響，探討其抗細(xì)菌內(nèi)毒素作用，為研究黃連提取物在抗菌機(jī)制方面的探索提供實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 黃連提取物（鹽酸小檗堿含量85%），由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：1100315。

1.2 動(dòng)物 Balb/C小鼠、大耳白家兔，沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供。合格證號(hào)：遼實(shí)動(dòng)質(zhì)字[2010]022號(hào)。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素 細(xì)菌內(nèi)毒素，中國(guó)藥品生物制品檢定所出品。效價(jià)：9000EU/amp。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，喂顆粒飼料，自由飲水，室溫（20±2）℃，濕度55%～60%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)毒素導(dǎo)致家兔發(fā)熱模型的建立及黃連提取物的治療[7] 取健康無(wú)病大耳白家兔，體重1.5 kg～2.5kg，每日測(cè)量體溫2次，連續(xù)測(cè)量3日，選擇體溫范圍在38.6℃～39.5℃，體溫波動(dòng)范圍在0.3℃以內(nèi)的家兔。隨機(jī)分為4組，每組6只。第一組為空白對(duì)照組、第二、三、四組分別為黃連提取物0.10g/kg、0.08g/kg、0.06g/kg三個(gè)劑量組。試驗(yàn)前分別測(cè)量肛溫兩次，間隔1小時(shí)，取平均值作為基礎(chǔ)體溫。各組動(dòng)物分別按2.5ml/kg灌胃給藥，空白組灌胃等容量的蒸餾水。給藥后1小時(shí)，耳緣靜脈注射1EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素0.8ml/kg，于注射后1、2、3、4、5小時(shí)各測(cè)體溫1次。計(jì)算體溫變化（致熱后體溫與基礎(chǔ)體溫之差△T℃）。

2.2 死亡保護(hù)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)小鼠致死劑量預(yù)試取健康小鼠24只，體重18g～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，禁食不禁水12小時(shí)。取細(xì)菌內(nèi)毒素按使用說(shuō)明書(shū)方法用注射用生理鹽水溶解至lml，超聲15分鐘，得9000EU/ml內(nèi)毒素溶液，再分別稀釋成9EU/ml、4EU/ml、2EU/ml、1EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。各組小鼠分別腹腔注射不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素0.5ml/只，觀察72小時(shí)，記錄小鼠的死亡數(shù)及死亡時(shí)間。

2.2.2 內(nèi)毒素小鼠感染模型的建立及黃連提取物的治療 取小鼠50只，隨機(jī)分成4組，每組10只，雌雄各半，第一組為空白組、第二、三、四組為鹽酸小檗堿0.30g/kg、0.24g/kg、0.19g/kg三個(gè)劑量組。各組小鼠每日灌胃給藥一次，連續(xù)給藥3日，于第一次給藥后1h，每只小鼠分別腹腔注射2EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素0.5ml/只，觀察72小時(shí)，記錄小鼠死亡數(shù)及死亡時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)果

3.1 黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)發(fā)熱家兔的解熱作用 黃連提取物三個(gè)劑量組（0.10g/kg、0.08g/kg、0.06g/kg）給藥后1、2、3、5小時(shí)，體溫都要顯著低于空白組。詳細(xì)的溫度數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

3.2 黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致小鼠死亡的保護(hù)作用 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)小鼠致死劑量預(yù)試結(jié)果顯示2EU/ml的內(nèi)毒素溶液給小鼠腹腔注射0.5ml/只，其致死率在80%以上，結(jié)果見(jiàn)表2。黃連提取物三個(gè)劑量組（0.30g/kg、0.24g/kg、0.19g/kg）小鼠的死亡率分別為30%，50%，50%.都明顯低于空白組的80%（表3），三個(gè)劑量組的小鼠平均死亡時(shí)間分別為14.67h，13.89h，12.16h，較空白組的5.51h明顯延長(zhǎng)（圖1）。以0.30g/kg組的作用效果較為明顯（P<0.05）。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，三個(gè)劑量組（0.10g/kg、0.08g/kg、0.06g/kg）的黃連提取物在給藥后1、2、3、4、5小時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致的家兔發(fā)熱都有較明顯的解熱作用，尤以0.08g/kg 劑量組作用最為明顯；三個(gè)不同劑量的黃連提取物（0.30g/kg、0.24g/kg、0.19g/kg）對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致小鼠死亡有一定保護(hù)作用，并可延長(zhǎng)內(nèi)毒素對(duì)小鼠的致死時(shí)間，以0.30g/kg組的作用效果較為明顯。

內(nèi)毒素能作用于巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，通過(guò)結(jié)合TLR4受體而被機(jī)體識(shí)別，從而引起先天免疫反應(yīng)，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有致熱性的細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素-1 、白細(xì)胞致熱源、腫瘤壞死因子、干擾素、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1和睫狀體促神經(jīng)因子等[8-10]。LPS 是目前已知的誘導(dǎo)IL-1和TNF 最重要的因子。研究發(fā)現(xiàn)，濃度為25 ng/L～50 ng/L的LPS 可以使新鮮人血中的單核細(xì)胞生成IL-1 和TNF[11]。這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。內(nèi)毒素引發(fā)炎癥反應(yīng)不僅會(huì)使機(jī)體發(fā)熱，并且也會(huì)導(dǎo)致腹瀉，甚至引發(fā)死亡。黃連提取物可能是通過(guò)阻斷了內(nèi)毒素引發(fā)炎癥的信號(hào)通路，從而呈現(xiàn)出解熱，死亡保護(hù)的作用。

近年來(lái)，人們?cè)O(shè)計(jì)合成出多種抗內(nèi)毒素感染的藥物。而作為一種傳統(tǒng)的祖國(guó)醫(yī)藥，黃連具有見(jiàn)效快，副作用小，且成本低等特點(diǎn).所以黃連可以取代昂貴或副作用大的藥物，廣泛的應(yīng)用于臨床治療中。且近年抗生素濫用的現(xiàn)象極其嚴(yán)重，一些細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥現(xiàn)象。黃連提取出的生物堿與抗生素聯(lián)合使用抗菌不僅可以提高抗生素抗菌活性，且可以減少抗生素的濫用。基于此，黃連在抗菌方面具有很大的應(yīng)用前景，進(jìn)一步深入研究黃連提取物抗菌機(jī)制意義重大。

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