綠豆多肽制備工藝的研究進展

[摘要]綠豆含有多種營養(yǎng)與活性成分，具有很好的食用、保健和美容功效。本文著重對綠豆及其萌芽多肽的制備工藝進行了綜述。

[關(guān)鍵詞]綠豆；多肽；制備工藝

綠豆（Mung bean），為豆科豇豆屬綠豆（Vigna radiatus Linn.）的成熟種子。綠豆作為我國主要的糧食作物之一，在我國已有兩千多年的栽培史，分布非常廣泛，產(chǎn)量極為豐富。綠豆用途廣泛，營養(yǎng)豐富，被譽為糧食中的綠色珍珠，既是食用佳品，又是重要的藥材和化妝品原料。

綠豆中蛋白質(zhì)含量高于常見的谷物蛋白質(zhì)，但是低于大豆蛋白質(zhì)，同時因產(chǎn)地和品種的差異而不同。綠豆中氨基酸種類齊全，富含谷物普遍缺乏的賴氨酸，其含量與雞蛋蛋白質(zhì)賴氨酸含量相當(dāng)。綠豆蛋白經(jīng)過酶解后，可以得到具有不同分子量和不同功效的肽，比如抗氧化肽和抗菌肽。

相比綠豆蛋白質(zhì)來講，多肽的氨基酸組成與結(jié)構(gòu)幾乎沒有變化，但相對分子質(zhì)量較小，具有較好的水溶性、較低的黏度、穩(wěn)定性很強等優(yōu)點。多肽具有多種生理功效，比如抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、降膽固醇等作用。

李楊等利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，采用堿性蛋白酶進行酶解，其最佳的酶解工藝為pH9.37、酶解溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.0%、加酶量5000.02U/g的條件下，酶解4.76h，多肽含量可達(dá)到913.7 mg/g。

盧珍華等通過單因素實驗研究木瓜蛋白酶對綠豆分離得到的粗蛋白的水解作用，得到制備綠豆多肽的最佳水解條件為：底物濃度7%，酶濃度8%，反應(yīng)溫度65℃，在p H6.5時，反應(yīng)3h。并利用葡聚糖凝膠（SephadexG-25）柱層析測定綠豆多肽分子量。試驗結(jié)果表明，當(dāng)水解度為30%時，綠豆多肽分子量絕大多數(shù)在1000Da以下。

傅亮等用Alcalase堿性蛋白酶將得到的蛋白含量為778.5mg/g的粗蛋白進行酶解，他們以水解度DH為指標(biāo)，得到酶解最佳條件為：底物濃度為2%，（[E]/[S]）3.5%，溫度為55℃，pH9.0，酶解120min，得到的綠豆多肽提取液在4種抗氧化體系中均表現(xiàn)出較強的抗氧化性，具有良好的還原能力，其清除羥自由基和超氧陰離子的能力很好，其IC50分別是13.96，12.67mg/mL，抗脂質(zhì)過氧化能力的IC50為15.77mg/mL。

潘妍等用綠豆種子為原料，以蛋白質(zhì)含量和還原糖含量為指標(biāo)，從5種酶中綜合比較出堿性蛋白酶更優(yōu)于其他四種蛋白。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗，得到最佳酶解條件為：料液比1：25，加酶量為7%，提取時間為1h。并對提取液進行美白和抗氧化功效的初步研究。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品濃度為10%時，酪氨酸酶抑制率為49.98%，DPPH清除率為33.53%，·OH清除率為39.08%。利用高效液相色譜精確測定樣品蛋白分子量分布，其分子量主要分布在408.41～1830.64之間。

ACE抑制肽的制備

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）在人體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要的生理作用，一是它使無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為升壓物質(zhì)一血管緊張素II_二是它能使降壓物質(zhì)分解成失活片段，從而導(dǎo)致血壓升高。因此，通過抑制ACE的活性可以起到降血壓的作用。食物蛋白中存在著大量的并具有不同分子特性的ACE抑制肽分子片段。綠豆作為我們?nèi)粘Ｊ秤玫募Z食作物，從綠豆蛋白中提取出的ACE抑制肽安全性高，無副作用，且能提高綠豆的附加值。

龔琴等以購買的綠豆蛋白粉為原料制備綠豆ACE抑制肽，通過不同的酶進行酶解，并測定酶解產(chǎn)物的水解度和對ACE的抑制率。其中用堿性蛋白酶對綠豆蛋白進行酶解得到的產(chǎn)物，其水解度和ACE抑制率均最大。確定試驗所用的酶源后，通過單因素試驗得到的最適條件的基礎(chǔ)上。隨后選取對ACE抑制率有顯著影響的四個因素進行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，經(jīng)過優(yōu)化得到最優(yōu)條件為：底物濃度1.75%，酶解溫度55℃，酶解pH8.25，加酶量6200u/g。在此條件下，綠豆ACE抑制肽的抑制率為84.83%。

抗氧化肽的制備

抗氧化肽就是一類存在于生物體內(nèi)，能夠清除體內(nèi)自由基、抑制生物大分子物質(zhì)過氧化，具有極強的抗氧化活性的生物活性肽。隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，以及對人類疾病、衰老等機理研究的不斷深入，氧化應(yīng)激損傷和抗氧化保護作用的研究受到人們的普遍關(guān)注?？寡趸瘎┨貏e是天然存在于自然界的抗氧劑成為熱點研究內(nèi)容。

孫鍵采用傳統(tǒng)堿提酸沉法制備綠豆蛋白。首先用多功能粉碎機將脫皮綠豆粉碎，過100目篩備用。稱取一定量的脫皮綠豆粉，以1：15的料水比加入蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0（±0.02），在40℃水浴鍋中不斷攪拌提取20min。堿提取完成后，在4000r/min條件下離心20min，取上清液。用HCl溶液調(diào)節(jié)上清液的pH值為4.5（±0.02），靜置30min，使綠豆蛋白質(zhì)在等電點處凝聚沉淀。酸沉過程中必須嚴(yán)格控制加酸及攪拌的速度，控制不當(dāng)，即便是pH達(dá)到等電點時，蛋白質(zhì)仍然呈現(xiàn)絮狀漂浮狀，不能完全沉淀。制備的綠豆蛋白粉中蛋白質(zhì)的含量在75%以上。接著用中性蛋白酶進行酶解，制備綠豆抗氧化活性肽。通過一系列的試驗得出最佳酶解工藝參數(shù)為：底物濃度2%，酶解pH6.5，酶解溫度50℃，加酶量5000u/g，酶解時間120min。綠豆酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離，被分離成分子量大小不同的五種組分，其中1KDa-5KDa的組分所占的質(zhì)量比重最大，經(jīng)SephadexG-25凝膠柱色譜進一步分離純化后，得到了兩種分子量分別為3426Da和1272Da的綠豆抗氧化活性肽T1和T2。T1和T2均有較強的抗氧化能力，T1對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別為69.14%和58.62%；T2清除羥白由基和DPPH自由基的能力分別為91.70%和74.68%。通過HPLC法對綠豆抗氧化活性肽T1和T2的純度進行了檢測，T1的純度為85.92%，T2的純度為94.99%。用全自動氨基酸分析儀對純化后的綠豆抗氧化活性肽T1、T2進行了氨基酸組成的檢測，結(jié)果表明，綠豆抗氧化活性肽T1、T2都含有16種相同的氨基酸，包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、擷氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸，其氨基酸總量分別為65.55%和85.11%，其中必需氨基酸的總量分別占22.98%和27.22%。所測的16種氨基酸中，兩種樣品中谷氨酸和天冬氨酸的含量最高。

抗菌肽的制備

近十年來，隨著動物及微生物抗菌肽理論與應(yīng)用研究的逐漸深入，植物抗菌肽的抑菌特性使其具有抗生素所不具有的一系列優(yōu)點，導(dǎo)致近年來對植物抗菌肽的研究十分活躍。與抗生素相比，抗菌肽具有不同的抑菌機理。抗生素是通過一系列酶合成的產(chǎn)物，而抗菌肽則是某個特定基因編碼的產(chǎn)物。在抑菌機理上，抗生素一般是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)或DNA等的合成來達(dá)到殺菌的目的，所以抗生素抗菌的一般是用特殊的受體，細(xì)菌容易通過變異對抗生素產(chǎn)生抗性，而抗菌肽一般沒有特殊的受體，抗菌肽一般是通過物理作用造成細(xì)胞膜的穿孔而達(dá)到廣譜的抗菌效果，因此抗菌肽的使用不會產(chǎn)生抗藥性和交叉抗性。部分的抗菌肽還具有抗病毒、抗腫瘤的作用?？咕倪@些獨特的性質(zhì)展示出廣闊的應(yīng)用前景。

吳金鴻在4℃下用蒸餾水浸泡綠豆過夜，使綠豆充分溶脹，瀝干蒸餾水，加少量0.2mol/L醋酸一醋酸鈉緩沖液（pH5.4），勻漿，經(jīng)紗布過濾，去除綠豆殘渣，得到濾液綠豆汁。將濾液在4℃下經(jīng)12000rpm離心20分鐘，取上清液加硫酸銨，使其飽和度達(dá)到20%，磁力攪拌30分鐘后靜置于4℃冰箱中4小時，然后在4℃下以12000 rpm離心20分鐘，取上清液。在上清液中加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到80%，磁力攪拌30min后靜置4℃冰箱中12小時，在4℃下以12000rpm離心20min，收集沉淀物，以0.2mol/L醋酸一醋酸鈉緩沖液（pH5.4）溶解沉淀，并在4℃下用0.2mol/L醋酸一醋酸鈉緩沖液（pH5.4）充分透析，得到初分離樣品。再利用CM—Sephadex C-50弱陽離子交換色譜和POROS20HS高效液相強陽離子交換色譜等分離技術(shù)，從綠豆中分離純化出一個抗菌肽——非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白（pm-nsLTP1）。pm-nsLTP1經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量為9292.97Da；SDS-PAGE電泳結(jié)果表明pm-nsLTPl是單倍體蛋白，具有分子內(nèi)的二硫鍵；pm-nsLTPl對真菌菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白絹病菌具有明顯的抑菌效果；pm—nsLTP1對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌也具有一定的抑制作用，最低抑菌濃度MIC值為0.06mmol/ml。

結(jié)論

綜上所述，綠豆蛋白質(zhì)類的提取主要是直接提取粗蛋白，或者是將粗蛋白進一步的酶解成多肽，多肽的分子量主要分布在10000Da以下。綠豆中蛋白或多肽的提取方式主要是用傳統(tǒng)的堿提酸沉，或者是用不同pH值的緩沖溶液提取，再用硫酸銨逐級沉淀，得到粗蛋白提取物的蛋白含量在70%以上。將粗蛋白進一步酶解就得到多肽，主要應(yīng)用的酶源有堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、NG、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。在眾多的酶源中，以堿性蛋白酶的水解度最好，得到的樣品功效性很強。為了進一步分離純化多肽，可以利用高效液相色譜精確測定樣品的蛋白分子量分布，也可以應(yīng)用超濾法對粗蛋白進行分子量分段，得到具有功效性明顯的分子段。再經(jīng)過SephadexG-25凝膠柱色譜、離子交換色譜、親和層析和反相高壓液相等層析方法進行進一步分離純化，得到單一峰值的多肽分子，并可用SDS-PAGE電泳確定該多肽為單一區(qū)帶，并對其分子量、酶活力進行測定。

多肽的研究主要集中于綠豆中，而綠豆萌芽過程中，在酶活性增加的過程中，部分蛋白質(zhì)隨著時間的變化發(fā)生分解，活性可能相應(yīng)提高，對不同萌芽天數(shù)蛋白質(zhì)分子量變化、提取工藝及活性的研究尚處于起步階段。因此，對于綠豆及其萌芽多肽的研究，一方面可以進一步優(yōu)化和改進綠豆中蛋白質(zhì)及多肽的提取工藝；另一方面，可以對綠豆萌芽過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性變化及相應(yīng)的蛋白質(zhì)（多肽）提取工藝進行系統(tǒng)深入研究，為綠豆及其萌芽作為健康食品和化妝品原料的日常應(yīng)用，提供合理依據(jù)。