復(fù)方植物抑菌活性提取工藝的優(yōu)化

[摘要]目的：研究植物去屑組合物的最優(yōu)提取工藝，以糠秕馬拉色菌為供試菌，測定其的抑菌效果。方法：通過管碟法濺試抑菌效果，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定植物去屑組合物的最優(yōu)提取工藝。結(jié)果：植物去屑組合物最優(yōu)提取工藝為70%乙醇回流提取，提取料液比1：25，提取時間2h，提取溫度65℃時，植物去屑組合物的抑菌效果最優(yōu)。結(jié)論：植物去羈組合物醇提物對糠秕馬拉色菌的抑菌活力為高度敏感。

[關(guān)鍵詞]植物去屑組合物，糠秕馬拉色菌，提取，抑菌

馬拉色菌是形成頭皮屑的重要因素之一，馬拉色菌的消長與頭皮屑的多少具有直接相關(guān)性。目前，抑制馬拉色菌的藥物研究主要以化學(xué)類的抗真菌制劑為主，如酮康唑、氯咪巴唑、吡硫翁鋅等，但此類物質(zhì)刺激性較大，而且容易產(chǎn)生耐藥性。以常用去屑劑吡硫翁鋅（ZPT）為例，張旋等研究證明ZPT對麥穗魚、青鱂、直突搖蚊亞科2齡幼蟲屬劇毒物質(zhì)。SarahD.等研究指出，ZPT可能導(dǎo)致人類角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的熱休克并引起DNA損傷。雖然，早在1981年美國FDA就公布并認(rèn)可ZPT在微量用于日用品成分的情況下對人體沒有危害，但此類物質(zhì)仍存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究復(fù)方植物去屑劑具有重要意義。

本研究復(fù)方中藥植物添加劑采用大黃、苦參、白蒺藜、生黃精，合理配伍，相互協(xié)調(diào)，共奏去屑止癢之效。大黃，苦寒泄熱，去瘀血，蕩滌實(shí)熱積滯；苦參，清熱解毒、燥濕利尿、祛風(fēng)殺蟲；白蒺藜，祛風(fēng)止癢，行氣活血；生黃精，補(bǔ)腎益精，滋陰潤煤，是多種復(fù)方滋補(bǔ)藥劑的重要組分，復(fù)方中藥合理配伍，共奏良效。

一、材料

1.受試中藥提取物

植物去屑組合物，購白同仁堂國藥店。

陽性對照ZPT，購自濱海明紅精細(xì)化工有限公司。

溶劑，乙醇，丙二醇，丁二醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.菌種

糠枇馬拉色菌ATCC44344，購自廣東微生物菌種保藏中心。

3.培養(yǎng)基

橄欖油培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母浸膏0.1g，單硬脂酸甘油酯2.5g，吐溫-802mL，橄欖油40mL，瓊脂18g，水1L。

4.儀器

RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SZCL-L型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），TELSTAR mini-V/PCR型超凈工作臺（西班牙泰事達(dá)丁ELSTAR），SHP-150型生化培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器責(zé)任有限公司），LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）。

二、方法

1.植物去屑組合物提取液的制備

植物去屑組合物，粉碎，稱量10g植物去屑組合物粉末，裝入500mL三口圓底燒瓶中，加入適量提取溶劑，在恒溫水浴鍋中回流提取，粗過濾，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮去除乙醇，加丙二醇復(fù)溶至0.2g·mL^-1的植物去屑組合物提取液，滅菌保存，備用。

2.抑菌效果的測定

菌種的活化：菌種購買來時均為裝入安瓿管中的凍干粉。實(shí)驗(yàn)時，用75%的酒精擦洗安瓿管，然后用酒精燈灼燒安瓿管的頂端，接著迅速滴加無菌水使其冷卻，再用鑷子敲掉安瓿管頭部，用移液槍滴加0.1mL左右的液體培養(yǎng)基于安瓿管中，用手震蕩搖勻，此時安瓿管中菌種凍干粉為黏稠狀。接下來就可以用接菌環(huán)挑菌接入相對應(yīng)的平板和斜面上進(jìn)行活化，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

菌懸液的制備：取活化好的菌種若干，在無菌條件下，分別挑取一環(huán)已活化好的菌種放入9m L無菌水中震蕩搖勻、分級制成一系列菌懸液。麥?zhǔn)媳葷峁苤瞥删鷳乙簼舛葹?06cfu/mL。

抑菌實(shí)驗(yàn)（管碟法）：將預(yù)先熔化好、并滅菌處理過的培養(yǎng)基，輕輕搖勻后傾注平板，冷卻凝固，每個平板15mL左右。取馬拉色菌的菌懸液200μL于培養(yǎng)基中，均勻涂布，蓋好平皿，置室溫干燥5min。在每個培養(yǎng)皿上方均勻擺放3個牛津杯，3個牛津杯中每個注入260μL同種中藥提取液，作為3個平行，以無菌水為陰性對照，同時選用常用抗真菌劑ZPT做陽性對照。將培養(yǎng)皿放入35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，然后取出，觀察，拍照，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

體外抑菌定性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于8mm為不敏感（-），8～13mm為低度敏感（+），13～19mm為中度敏感（+），19mm以上為高度敏感（+++）。3次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格，陰性對照組無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無效。

3.提取方法的選擇

分別用水浴提取、回流提取、超聲提取、微波提取、閃式提取5種提取方法提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取溶劑70%乙醇，提取時間60min，提取溫度75℃。以糠秕馬拉色菌為公試菌株，采用管碟法對植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測定，通過比較5種提取方法對植物去屑組合物抑提取物的菌效果確定適合的提取方法。

4.提取溶劑的選擇

分別用水、乙醇、丙二醇、丁二醇4種提取溶劑提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取時間60min，提取溫度75℃。采用管碟法對植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測定，通過比較4種溶劑提取對植物去屑組合物的抑菌效果確定適合的提取溶劑。

5.單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)研究料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度對植物去屑組合物抑菌效果的影響。

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物抑菌效果的影響

分別用乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取時間60min，提取溫度75℃。采用管碟法對植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測定，確定適合的濃度。

2）提取時間對提取物抑菌效果的影響

分別按時間為0.5、1、1.5、2、3h回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取溶劑70%乙醇，提取溫度75℃。采用管碟法對植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測定，確定適合的提取時間。

3）提取溫度對提取物抑菌效果的影響

分別在溫度為45、55、65、75、85℃的恒溫電熱加熱套中回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取溶劑70%乙醇，提取時間60min。采用管碟法對植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測定，確定適合的提取溫度。

4）料液比對提取物抑菌效果的影響

分別按料液比為1：5、1：10、1：15、1：20、1：25回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：提取溶劑70%乙醇，提取時間60min，提取溫度75℃。采用管碟法對植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測定，確定適合的料液比。

6.提取工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度4個因素、3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化植物去屑組合物抑菌成分的提取工藝，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

三、結(jié)果與分析

1.提取方法對植物去屑組合物抑菌效果的影響

考察5種提取方法對植物去屑組合物抑菌效果的影響，由表2可知，回流提取方法抑菌效果最好，因此確定回流提取為最終提取方法。

2.提取溶劑的選擇

考察4種提取溶劑對植物去屑組合物抑菌效果的影響，由表3可知，乙醇溶液提取物的抑菌效果最好，因此確定乙醇作為提取溶劑。

3.乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物抑菌效果的影響

由圖3可知，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的提高，抑菌圈增大，體積分?jǐn)?shù)在70%時抑菌效果最好。體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，一些醇溶性雜質(zhì)成分溶出，干擾因素增多，導(dǎo)致抑菌效果下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇在70%較為適宜。

由圖4可知，隨著提取時間的延長，植物去屑組合物抑菌圈逐漸增大，但增加的幅度并不明顯，當(dāng)提取溫度為2h時提取物抑菌效果最好。提取時間繼續(xù)延長時，提取液抑菌效果降低。原因可能是長時間的加熱提取提取破壞了部分抑菌活性物質(zhì)。因此，提取時間選擇在2h。

由圖5可以看出，隨著提取溫度的提高，抑菌圈增大，溫度在75℃時抑菌效果最好。溫度繼續(xù)增加時，抑菌活性下降，可能是高溫破壞了一些抑菌成分。因此提取溫度選擇在75℃較為適宜。

6.料液比對提取物抑菌效果的影響

由圖6可以看出，隨著料液比的增大，抑菌效果增加不明顯，在1：10～1：15時，抑菌效果最好。料液比繼續(xù)增大時，抑菌活性下降，原因可能是溶劑量增加，水溶性雜質(zhì)溶出率增加，導(dǎo)致抑菌效果下降。因此料液比選擇1：10～1：15較為適宜。

7.提取工藝條件的優(yōu)化

由表4極差R值可知，四個因素對抑菌率影響程度B>C>A>D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>反應(yīng)時間>料液比>反應(yīng)溫度，由正交實(shí)驗(yàn)K值可知，最佳提取條件為ABCD，與正交表中最優(yōu)抑菌組合ABCD不相符，重復(fù)ABCD試驗(yàn)，抑菌圈直徑23.08mm，大于ABCD的21.87mm。因此植物去屑組合物抑菌成分最優(yōu)提取條件為ABCD，即料液比1：25，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間2h，提取溫度65℃。

由表5對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，因素B即乙醇體積分?jǐn)?shù)對結(jié)果有顯著性影響。

四、結(jié)論

乙醇回流提取植物去屑組合物中的活性成分，不僅提取工藝簡單，而且容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。本實(shí)驗(yàn)研究探討了不同提取方法、提取溶劑、提取料液比、提取時間、提取溫度對植物去屑組合物抑菌效果的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了植物去屑組合物抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為：料液比1：25，70%乙醇，時間2h，溫度65℃。