RP-HPLC法測(cè)定腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑中維生素A棕櫚酸酯的含量

莫 鳴

江蘇省榮軍醫(yī)院藥劑科，江蘇無(wú)錫 214035

腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)（EN）給藥是經(jīng)口服或管飼提供滿足或補(bǔ)充代謝需要的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)及其他各種營(yíng)養(yǎng)素的營(yíng)養(yǎng)支持方式［1-2］。近年來(lái)，營(yíng)養(yǎng)支持尤其是腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持在各種危重患者的臨床應(yīng)用中愈加受到重視［3-5］。腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑（瑞素）含蛋白質(zhì)、多種水溶性維生素、脂溶性維生素及多種微量元素，其中維生素A就是其中重要的脂溶性維生素之一。通常采用紫外三點(diǎn)校正法測(cè)定維生素A含量［6-7］；但復(fù)方制劑中由于成分復(fù)雜、相互干擾，紫外分光光度法因?qū)傩圆疃鵁o(wú)法對(duì)復(fù)方制劑中的維生素A進(jìn)行檢測(cè)。既往研究顯示，可應(yīng)用固相萃取高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定魚(yú)肝油乳中維生素A含量［8-10］。但腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑中富含蛋白質(zhì)，無(wú)法固相萃取其中的維生素A。本研究建立了以石油醚（沸程60～90℃）為溶劑的萃取法，并利用反相高效液相色譜法（RPHPLC）測(cè)定腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑（瑞素）中的維生素A棕櫚酸酯含量，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

維生素A棕櫚酸酯對(duì)照品購(gòu)自DSM公司（批號(hào)為0000018484，含量為1832946IU/g）；腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液由華瑞制藥有限公司提供，商品名瑞素（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20020588，批號(hào)：80BF105），其處方見(jiàn)表1。甲醇，色譜純，購(gòu)自Merck公司；石油醚（沸程：60～90℃），分析純，為國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；無(wú)水乙醇，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。1100型高效液相色譜儀及其化學(xué)工作站購(gòu)自Agilent公司。

圖1 樣品溶液中維生素A棕櫚酸酯色譜圖

圖2 對(duì)照品溶液中維生素A棕櫚酸酯色譜圖

表1 瑞素處方（每1000mL含）

1.2 RP-HPLC測(cè)定方法

1.2.1 流動(dòng)相和色譜條件 選擇Thermo Hypersil ODS C18柱（5μm，4.0mm×250mm）為色譜柱，以甲醇︰水（97︰3，V/V）為流動(dòng)相，泵流速為2.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，進(jìn)樣量為20μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取維生素A棕櫚酸酯對(duì)照品15mg，置100mL量瓶中，加石油醚溶解并稀釋至刻度。精密量取1mL置100mL量瓶中，加石油醚稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制 精密稱取瑞素樣品20g（密度為1.068g/mL），加入20mL石油醚中劇烈振搖5min，加入40mL無(wú)水乙醇，再振搖3min，放置分層。取上清液為樣品溶液。

1.2.4 維生素A棕櫚酸酯含量測(cè)定 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算獲得維生素A棕櫚酸酯含量［11-12］。

1.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取樣品溶液進(jìn)樣20μL，在325nm處測(cè)定，理論塔板數(shù)為5327，說(shuō)明柱效較高，完全能滿足本次實(shí)驗(yàn)。利用二極管陣列檢測(cè)器和化學(xué)工作站，測(cè)定維生素A棕櫚酸酯的峰純因子為999.930，說(shuō)明此峰中無(wú)其他未分離組分（圖1）。

1.2.6 專屬性試驗(yàn) 配制不含維生素A棕櫚酸酯的陰性樣品溶液，同時(shí)進(jìn)樣此樣品溶液和1.2.2中制備的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，樣品溶液在維生素A棕櫚酸酯處不出峰（圖2）。

表2 線性試驗(yàn)結(jié)果

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 樣品回收率測(cè)定

1.2.7 線性試驗(yàn) 精密稱取維生素A棕櫚酸酯10、15、25、50、100mg，用石油醚（沸程為60～90℃）分別溶解并制成1.00、1.50、2.50、5.00、10.00μg/mL溶液，取20μL進(jìn)樣，每份進(jìn)樣2次，以濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按1.2.3方法制備6份樣品溶液，取樣品溶液20μL進(jìn)樣，計(jì)算樣品溶液中維生素A棕櫚酸酯峰面積與樣品稱重比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.9 中間精密度試驗(yàn) 采用另外一臺(tái)Agilent 1100型高效液相色譜儀，按上述方法測(cè)定6次，計(jì)算樣品中維生素A棕櫚酸酯峰面積與樣品稱重比值的RSD值。

1.2.10 回收率試驗(yàn) 稱取維生素A棕櫚酸酯16.5527mg，按1.2.2方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密稱定已知含量的瑞素6份各20g，分別加入20.00mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，劇烈振搖5min，加入40.0mL無(wú)水乙醇，再振搖3min，取上清液進(jìn)樣，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果

以濃度C為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到線性回歸方程為A=42.9971C-1.2916，相關(guān)系數(shù)r=0.9992（表2），表明維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)的RSD為2.0％（n=12），表明重復(fù)性和中間精密度好（表3～4）。樣品回收率為99.51％，回收率RSD=1.2％（表5），表明此方法結(jié)果準(zhǔn)確。通過(guò)陰性樣品試驗(yàn)和峰純度檢查說(shuō)明本方法專屬性較好（圖1～2）。

3 討論

腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑（瑞素）為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜、干擾較多，測(cè)定時(shí)我們先使用石油醚對(duì)樣品充分乳化，使得維生素A棕櫚酸酯酯充分分散到石油醚中，然后使用乙醇作為破乳劑將樣品充分震搖而產(chǎn)生破乳，最終使石油醚層與乙醇層迅速分離。對(duì)于破乳劑應(yīng)先確定其是油溶性還是水溶性，水溶性破乳劑用水作為溶劑，油溶性破乳劑通常用甲醇作為溶劑，考慮到甲醇的毒性，采用無(wú)毒乙醇作為替代品，收到了良好效果［13-14］。

石油醚的沸程有30～60℃、60～90℃和90～120℃，此數(shù)值是指餾分不同，30～60℃沸程是指其中餾分的初餾點(diǎn)不低于30℃，終餾點(diǎn)不高于60℃，其他依此類推。因此，30～60℃沸程的石油醚最容易揮發(fā)，60～90℃次之，90～120℃相對(duì)不易揮發(fā)，但與樣品的乳化能力稍差［15］。我們采取60～90℃沸程的石油醚，其不易揮發(fā)，又有較強(qiáng)和樣品充分乳化的能力，能更好地萃取，故選擇其作為萃取溶劑。

使用石油醚溶解維生素A棕櫚酸酯在紫外分光光度計(jì)中掃描，測(cè)得其最大吸收波長(zhǎng)為325nm［13］，故本實(shí)驗(yàn)采用325nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。樣品取樣采用稱重而不是體積是為了取樣更準(zhǔn)確。因?yàn)槟c內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑富含蛋白質(zhì)和脂肪，有一定黏稠度，量取體積會(huì)增加實(shí)驗(yàn)誤差。此外，對(duì)照品和樣品溶液制備時(shí)要盡量避光或在暗光下操作，雖然維生素A棕櫚酸酯的穩(wěn)定性較醋酸酯高，但制備好的溶液仍盡可能快速進(jìn)樣分析，以防維生素A棕櫚酸酯在溶液中降解［16］。

本研究建立并應(yīng)用RP-HPLC法測(cè)定腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑中的維生素A棕櫚酸酯含量，發(fā)現(xiàn)維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9992），重復(fù)性和中間精密度較高（RSD=2.0％）；測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，樣品回收率為99.51％，回收率RSD=1.2％；且專屬性較好。本研究結(jié)果表明，RP-HPLC法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、精密度好且無(wú)干擾，可用于腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑中維生素A棕櫚酸酯含量測(cè)定。

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