CRISPR技術(shù)在改良植物抗病性中的應(yīng)用

羅麗婷 蔣君梅 李向陽 謝鑫

摘 要：基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，已成為植物抗病育種的重要手段之一。近年來，CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列）技術(shù)由于設(shè)計和操作簡單、成功率高、通用性強(qiáng)、成本低以及遺傳編輯之后不會造成外源基因污染等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物抗病基因改良。CRISPR由幾個不連續(xù)的直接重復(fù)序列組成，具有切除入侵病毒和外源DNA，保護(hù)自身免受侵染的功能。本文綜述了CRISPR技術(shù)在單子葉植物（水稻、小麥、玉米、香蕉）和雙子葉植物（擬南芥、煙草、番茄）抗病基因改良中的應(yīng)用，討論其優(yōu)缺點并展望其應(yīng)用前景，以便促進(jìn)該技術(shù)在改良植物抗病性中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：CRISPR技術(shù);抗病性;基因編輯

中圖分類號：S332.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）04-0046-12

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.007

Abstract：With the rapid development of genome editing technology，it has become one of the important means of plant disease resistance breeding.In recent years，CRISPR technology has been widely used in plant disease resistance gene improvement due to its advantages of simple design and operation，high success rate，strong versatility，low cost，and no pollution of exogenous genes after genetic editing.CRISPR consists of several discontinuous direct repeat sequences，which have the function of removing invading viruses and foreign DNA and protecting itself from infection.This paper reviewed the application of CRISPR technology in the improvement of disease resistance genes of monocotyledons （rice，wheat，maize，banana） and dicotyledons （Arabidopsis thaliana，tobacco，tomato），discussed its advantages and disadvantages，and prospected its application prospect，so as to promote the application of CRISPR technology in the improvement of disease resistance of plants.

Keywords：CRISPR technology; disease resistance;gene editing

全球的糧食問題一直以來都是被廣泛關(guān)注的焦點，盡管造成糧食產(chǎn)量損失的因素很多，但作物病害的普遍發(fā)生卻一直都是限制其生產(chǎn)的主要因素之一[1-2]。作物易受各種真菌、細(xì)菌和病毒的侵染，而造成巨大的產(chǎn)量損失[3]。隨著科學(xué)研究的不斷深入，增強(qiáng)作物抗病性已被證實是病害防治的重要方法之一[4-5]。近年來基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，已成為增強(qiáng)植物抗病性的重要手段之一[2，4，6]?；蚪M編輯技術(shù)依靠基因工程核酸酶切割特定的DNA序列來產(chǎn)生特定位點的雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs），使DNA通過非同源末端連接（nonhomologous end-joining，NHEJ）或同源重組（homologous recombination，HR）被修復(fù)，這一過程常常導(dǎo)致堿基替換、插入和缺失以及相關(guān)基因的突變。其方法主要包括利用巨核酸酶、鋅指核糖核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9）進(jìn)行定點修飾[3，5，7-8]。

不同于ZFN和TALEN技術(shù)操作的復(fù)雜性及耗時性，CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)只需要改變20 bp的gRNA便可靶向不同的基因[6，9]。除了用于動物中的抗病毒研究，近年來，CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)同樣也被應(yīng)用于植物的抗病育種中[7，10]。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有設(shè)計和操作簡單、成功率高、通用性強(qiáng)、成本低、遺傳編輯之后不留有外源基因污染等優(yōu)點[1，4，7，9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB（雙鏈斷裂）和雙生病毒（植物病毒家族，具有單鏈環(huán)狀DNA基因組，宿主范圍廣泛，可作為HDR過程中的修復(fù)模板）載體，可獲得足量供體DNA導(dǎo)入細(xì)胞，提高靶向KI（基因敲入）效率[11-13]。上述研究使CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的使用率在很大程度上已經(jīng)超過其他基因組編輯技術(shù)，成為科學(xué)家所掌握的對基因組進(jìn)行精確編輯的最有效的工具[4，14]。2020年10月7日，瑞典皇家科學(xué)院將2020年諾貝爾化學(xué)獎授予Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，以表彰她們發(fā)現(xiàn)CRISPR / Cas9基因剪刀，在基因組編輯領(lǐng)域做出了巨大的貢獻(xiàn)。CRISPR于1987年在大腸桿菌中被首先發(fā)現(xiàn)，之后研究人員接連在各種細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中觀察到了相似的結(jié)構(gòu)，于2002年正式提出了CRISPR的概念[3，15-17]。CRISPR具有為自身提供特異性免疫保護(hù)機(jī)制，抵御外來病毒、質(zhì)粒等遺傳元件入侵的功能[2，4，18]，還會與Cas蛋白結(jié)合形成CRISPR/Cas系統(tǒng)，能對目標(biāo)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的直接修飾[19]。本文將從CRISPR技術(shù)在植物抗病基因改良中的應(yīng)用入手，討論其優(yōu)缺點，并展望CRISPR在植物抗病基因改良中的應(yīng)用前景。

1?CRISPR及組成

CRISPR由兩部分組成，即CRISPR基因座和由Cas蛋白家族編碼的基因[20-21]。其中CRISPR基因座由前導(dǎo)序列 （Leader Sequence）、CrRNA （CRISPR RNA）和一系列高度保守的重復(fù)序列（Repeat）與隨機(jī)的間隔序列 （Spacer）交替排列組成（圖1）[7，22-23]。Cas系列蛋白編碼基因以操縱子的形式排列，具有間隔區(qū)獲得、CrRNA加工、靶點切割和其他輔助作用 [24-27]。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要通過獲得性免疫，抵抗病毒和外源 DNA的入侵 [22，25]。由于Cas基因的核心元件序列各不相同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為三種不同的類型（I型、II型和III型）[26，28]。但這三種不同類型的系統(tǒng)都包含兩個通用基因：Cas1（不具有序列特異性的金屬依賴性DNA酶，可能參與外源DNA的侵入過程）和Cas2（金屬依賴性內(nèi)核糖核酸酶，可能參與間隔區(qū)的獲得過程）[20，27，29]，且各具有一個獨特的特征基因，分別為Cas3（可編碼具有獨立的解旋酶和DNA酶活性的大蛋白和可能形成具有不同組成的級聯(lián)狀復(fù)合物的蛋白質(zhì)的基因）、Cas9（含有RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域的大蛋白）和Cas10（含有與核酸聚合酶和核苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域的蛋白） [30-35]。因此，這三種系統(tǒng)的功能及操作方式具有相似性但又有所不同，例如三種系統(tǒng)的功能都主要依賴于crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA （Trans-activating chimeric RNA） 結(jié)合形成的雙元復(fù)合體引導(dǎo)Cas（CRISPR-associated system） 蛋白對外源 DNA 進(jìn)行序列特異性降解[36-40]，但在對DNA雙鏈進(jìn)行切割時，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個Cas蛋白形成復(fù)合體才能操作，而Ⅱ型則只需要1個Cas9蛋白即可完成[28，39]。

不同于傳統(tǒng)植物基因編輯技術(shù)，植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以通過一個雙元載體的T-DNA構(gòu)建多個sgRNA 表達(dá)盒，并使每種sgDNA攜帶不同的靶序列或利用前體tRNA剪切產(chǎn)生多種sgDNA[41-45]，實現(xiàn)同時對多個基因位點的編輯，大大提高了基因編輯的效率。因而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)比其他兩種系統(tǒng)使用的更廣泛。如今CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被應(yīng)用到擬南芥、煙草、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組編輯的研究中 [20，25，29，35，40]，已成為現(xiàn)今公認(rèn)的增強(qiáng)作物抗病性的重要手段之一（圖1）。而由CRISPR/Cas9系統(tǒng)衍生的一系列基因編輯技術(shù)，如利用CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建RGNs系統(tǒng)（由RNA引導(dǎo)核酸酶（RGNs）在特定的位置使DNA雙鏈斷裂（DBS））修復(fù)序列的方法也已被廣泛用于靶向基因組的編輯中[46-48]。

2?CRISPR技術(shù)在單子葉植物抗病中的應(yīng)用

2.1?CRISPR技術(shù)在水稻抗病中的應(yīng)用

2.1.1?CRISPR技術(shù)在防治水稻真菌病害中的應(yīng)用——以水稻稻瘟病為例

水稻（Oryza sativa L.）為世界三大糧食作物之一，為單子葉模式植物[49]，如其他許多作物一般易受自然界各種病原物的侵染，而導(dǎo)致每年產(chǎn)量損失巨大，因而對其進(jìn)行分子生物學(xué)研究意義重大[50，57]。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的一種破壞性極強(qiáng)的真菌病害，是水稻三大病害之一[49，58]。稻瘟病可以發(fā)生在水稻生長的任何時期，在我國已多次發(fā)生[51，59]。經(jīng)過多年的研究，抗性育種已被證實是防治該病害最有效的方法。由于稻梨孢具有小種變異快的特點，導(dǎo)致稻瘟病抗性品種在3～5年的田間種植之后就會喪失抗性[52-54]。在傳統(tǒng)的水稻抗病育種中，誘變育種和雜交育種是主要的育種方法[33]。通過人工選擇和抗性鑒定，將抗稻瘟病品種的抗性基因?qū)胨局仓?，從而培育出抗稻瘟病新品種[55]。該方法周期長、成功率低，已無法有效控制稻瘟病的發(fā)生[56]。

目前，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已在編輯水稻Pita、Pi21、Pi20、ERF922和bsr-d1等稻瘟病抗性相關(guān)基因方面得到應(yīng)用[51，60，62，66]。經(jīng)PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）鑒定及效率分析和對突變體稻瘟病的抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，靶位點存在多種突變類型，且突變率較高，突變體的抗性明顯高于野生型，即證明利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行抗稻瘟病育種的方法可行[49，53，61]。此外，隨著序列特異性核酸酶（Sequence specific nuclease，SSNs）的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，CRISPR/Cas9已被證實是最有效的SSNs[62-63]。以CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922）為主的水稻抗稻瘟病的工程已成功改良水稻OsERF922基因（抗稻瘟病負(fù)調(diào)控因子），大大增強(qiáng)了水稻對稻瘟病的抗性[53，64-66]，為培育水稻抗稻瘟病新品種帶來了新的機(jī)遇。

2.1.2?CRISPR技術(shù)在防治水稻細(xì)菌病害中的應(yīng)用——以水稻白葉枯病為例

水稻黃單胞菌水稻致病變種Xoo（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）是水稻白葉枯病的致病菌[67]。水稻白葉枯病是危害世界水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害之一[68]。Xoo 主要通過水稻葉片上的傷口或水孔侵入水稻維管束生長和大量增殖，阻塞維管束，從而導(dǎo)致水稻死亡[60，71]。已有研究證明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可敲除水稻Os8N3或SWEET13基因，增強(qiáng)水稻對Xoo的抗性[69-70]。利用CRISPR技術(shù)過對水稻OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWET14三個敏感基因進(jìn)行靶向編輯，已成功獲得具有廣譜抗白葉枯病性的水稻新品種[72-74]。而利用Cas9/sgRNA構(gòu)建水稻原生質(zhì)體細(xì)胞，以Xoo易感性基因OsSWEET14和OsWEET11啟動子區(qū)為靶點，即可培育對白葉枯病有抗性的水稻新品種[54，73，75]。

2.1.3?CRISPR技術(shù)在防治水稻病毒病中的應(yīng)用

植物病毒可引發(fā)多種病害，其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[76]。CRISPR來源于細(xì)菌和古生菌的基因組，其最初的功能是為細(xì)菌提供抗外源病毒的特異性免疫保護(hù)機(jī)制，因此也可用于植物抗病毒性的研究[3，6，11，17]。根據(jù)植物病毒需要在宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖的特性[77]，研究人員利用CRISPR技術(shù)在病毒侵染的關(guān)鍵時期對宿主細(xì)胞進(jìn)行定向編碼，即可獲得抗病毒植株[4，36，38]。例如，借助CRISPR/Cas9技術(shù)定向編碼產(chǎn)生的水稻eIF4G基因?qū)λ緰|格魯球形病毒（與水稻東格魯桿狀病毒共同作用引起水稻東格魯球形病毒?。┚哂锌剐訹78-80]，可用于水稻抗東格魯球形病毒?。釒喼匏旧a(chǎn)的一個嚴(yán)重制約因素）育種[79]。此外，研究發(fā)現(xiàn)通過CRISPR技術(shù)分別靶向南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）雙鏈RNA基因組的crRNA（CRISPR-derived RNA）和水稻條紋花葉病毒（RSMV）單鏈RNA基因組的crRNA，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因水稻植株分別對SRBSDV和RSMV有很好的抗性，即證明特異性靶向病毒基因組的crRNA-LshCas13a，使其過度表達(dá)是一種有效的抗RNA病毒的途徑[80-85]。

2.2?CRISPR技術(shù)在小麥抗病基因改良中的應(yīng)用——以小麥白粉病為例

小麥?zhǔn)鞘澜缛蠊任镏唬谑澜绺鞯貜V泛種植[86]。小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminis）引起的，其主要危害小麥葉片，而使小麥產(chǎn)量受損[154-155]。雖早有研究報道抗性育種為防治該病害最重要的方法之一[87-88]。但由于小麥關(guān)鍵基因的拷貝較多，致使育種過程需要的時間過長[89-90]。所以在使用傳統(tǒng)育種方法已成功培育出抗性水稻品種時，小麥的抗性育種卻一直沒有進(jìn)展。而如今得益于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對小麥某些負(fù)調(diào)控基因（如：RESISTANCE1（EDR1））進(jìn)行編輯[91-93]，使這些基因控制的性狀在不同程度上得到改良，即可獲得抗病、抗逆性品種[94]。此外，研究發(fā)現(xiàn)了3個TaMLO同源基因的突變可使小麥對白粉病產(chǎn)生廣譜抗性[95-96]，高彩霞課題組已于2014年利用CRISPR基因編輯技術(shù)成功修改了六倍體小麥的DNA，培育出抗白粉病小麥品種（Taedr1）[94，97]。

2.3?CRISPR技術(shù)在玉米抗病基因改良中的應(yīng)用——以雙生病毒病為例

玉米（Zea mays L.）是優(yōu)良的糧食作物，被廣泛種植于熱帶和溫帶地區(qū)，具有極好的環(huán)境適應(yīng)性[98]。由于與傳統(tǒng)的糧食作物小麥、水稻等相比玉米的種植環(huán)境大都比較惡劣，所以對玉米基因組的研究雖早已開展，但都主要集中于抗逆品種的培育及對其農(nóng)藝性狀的改良方面[99-100]。例如，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯ARGOS8（乙烯負(fù)調(diào)控因子）基因使其過量表達(dá)，可成功培育出抗旱高產(chǎn)的玉米[101]。而CRISPR技術(shù)在玉米抗病基因改良中的應(yīng)用，目前則主要集在于利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)培育抗雙生病毒病（常發(fā)生于熱帶和亞熱帶地區(qū)，可使玉米植株畸形，穗部細(xì)小，對其產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響）品種的研究中[102-104]，如培育玉米條斑病的抗性育種，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白和sgRNAs的過度表達(dá)可抑制雙生病毒基因組的復(fù)制，為玉米抗性育種的開展提供了基礎(chǔ)[105-107]。

2.4?CRISPR技術(shù)在香蕉抗病基因改良中的應(yīng)用——以病毒病為例

作為重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，香蕉（Musa nana Lour.）的生產(chǎn)常受香蕉條斑病毒（Banana streak virus，BSV）的影響[108]。該病毒可將自身的基因組整合到宿主的基因組中形成內(nèi)源BSV（eBSV），在脅迫條件下eBSV會活化對植物體進(jìn)行感染[109]。香蕉全基因組序列的已知加上再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，使基因編輯技術(shù)在香蕉上得到廣泛應(yīng)用[110]。但由于在香蕉主栽品種中存在整合的eBSV，使得香蕉種質(zhì)資源的保存和雜交育種的進(jìn)行依舊充滿挑戰(zhàn)[109，111]。據(jù)報道肯尼亞科學(xué)家團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向編輯eBSV，使其失活，已成功阻止感染性病毒顆粒[112]。相信隨著研究的深入，將來即可通過CRISPR/Cas9的靶向基因編輯永久地滅活內(nèi)源性eBSV，成功培育出抗條斑病毒的香蕉品種[113]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯香蕉eIF基因家族可獲得對香蕉束頂病毒屬（Babuvirus）的抗性[114];還可激活香蕉的內(nèi)源性防御基因，如抗病基因、致病相關(guān)基因、受體激酶和抗菌蛋白等[108，115]。如今，通過對抗病野生香蕉和感病香蕉轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，已成功找到了香蕉抗細(xì)菌病的靶基因[116]。使用CRISPR技術(shù)敲除單個或多個易感基因（如MLO13、DMR6）、轉(zhuǎn)運蛋白基因（如SWEET14）和負(fù)性調(diào)節(jié)因子（如E3泛素連接酶）可使香蕉對香蕉細(xì)菌性枯萎病菌產(chǎn)生抗性[117-119]。

3?CRISPR技術(shù)在雙子葉植物抗病中的應(yīng)用

3.1?CRISPR技術(shù)在擬南芥抗病基因改良中的應(yīng)用

擬南芥為雙子葉模式植物，素有“植物中的果蠅”之稱，是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的好材料[7]。研究人員在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對擬南芥進(jìn)行基因編輯時發(fā)現(xiàn)：通過對葉片組織進(jìn)行的綠色熒光信號標(biāo)記，成功在后代中檢測到被修飾基因的遺傳，且在F2代中仍有50%修飾[120-121]，證實由CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯的基因具有可穩(wěn)定遺傳的特性，可用于抗性品種的培育。加之發(fā)現(xiàn)擬南芥受病原物侵染時DMR6突變體（與水楊酸（SA）穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因缺失形成）的數(shù)量會增加，并與DLO1基因（DMR6同源基因）協(xié)同合作，積累SA（SA水平的提高是產(chǎn)生抗性的基礎(chǔ)）激活植物的免疫功能，而使擬南芥產(chǎn)生抗性[72，122-124]。且在雙子葉植物番茄、馬鈴薯等中都觀察到了類似可產(chǎn)生抗性的基因，使CRISPR技術(shù)得以在雙子葉植物抗病中得以廣泛應(yīng)用[12]。

近年發(fā)現(xiàn)的利用CRISPR/Cas13（Cas13酶，能特異性編輯RNA但不改變基因組）技術(shù)在擬南芥中構(gòu)建抗RNA病毒的CRISPR/Cas系統(tǒng)的方法，已成功應(yīng)用于原核生物中抵御RNA和DNA病毒[126]。而使用CRISPR/LshCas13a系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，以干擾蕪菁花葉病毒（TuMV）RNA基因組實驗的成功[80，83，85]。證實利用CRISPR / Cas13系統(tǒng)抗病毒策略的可行性，為雙子葉植物病毒病的防治提供了又一方案。

3.2?CRISPR技術(shù)在煙草抗病基因改良中的應(yīng)用

煙草是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，因其品質(zhì)極易受化學(xué)農(nóng)藥及其他物理因素（溫度、水分等）的影響，煙草的抗病育種研究顯得尤為重要[127-128]。目前，通過ZFN和TALENs，已成功靶向中國番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）、煙草卷曲莖病毒 （tobacco curly shoot virus，TbCSV）、煙草曲莖病毒（TbCSV）和云南番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Yunnan virus，TLCYnV）基因，賦予了轉(zhuǎn)基因煙草對這四種病毒的部分抗性[76-77]。此外，研究發(fā)現(xiàn)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向編輯雙生病毒基因組，可提高煙草對雙生病毒的抗性[129];CRISPR/FnCas9系統(tǒng)可有效抑制黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒在植物中的復(fù)制;C2c2（一種靶向RNA的新型CRISPR系統(tǒng)）可以切割單鏈RNA[130]，干擾蕪菁花葉病毒在植物中的復(fù)制;利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Va基因（單隱性基因，決定煙草對馬鈴薯Y病毒（PVY）的易感性），可培育抗PVY煙草植株[131]。研究人員利用來自新兇手弗朗西絲菌（Francisella novicida）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和沙氏纖毛菌（Leptotrichia shahii）的 CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)，成功賦予了煙草對RNA病毒的抗性，實現(xiàn)了廣譜抗病毒的目標(biāo)[132]。

由青枯雷爾氏桿菌（Ralstonia solanacearum （E.F.Smith） Yabuuchi et al.）引起的煙草青枯病，是對世界煙草產(chǎn)業(yè)具有重要影響的細(xì)菌性病害[133]。目前，已有研究證實煙草VQ基因家族（植株中廣泛存在的一類調(diào)節(jié)因子）與煙草對青枯病的抗性有關(guān)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯獲得的NtVQ35基因的植株對青枯病菌有負(fù)向調(diào)控作用[134]，且不會影響植株正常的生長和表型變化，可用于煙草抗青枯病育種。

3.3?CRISPR技術(shù)在番茄抗病基因改良中的應(yīng)用

番茄（Solanum lycopersicum）為茄科植物，是世界上最重要的農(nóng)作物之一，也是世界上第二大消費蔬菜[135]，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，因長期受植物病原菌（如丁香假單胞菌、黃單胞屬菌和疫霉屬菌物）的影響而損失巨大[136]。基于對其基因組研究工作的進(jìn)行，目前已成功在番茄基因組中鑒定出一個DMR6的同源基因（SlDMR6-1）[72]，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建番茄SlDMR6-1基因缺失植株結(jié)果顯示：該基因?qū)Χ喾N植物源菌物具有活性，且對植物的生長發(fā)育無明顯影響，即證明可利用該技術(shù)進(jìn)行抗病性番茄的培育[137]。目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對番茄中的廣譜抗白粉病mlo隱性突變基因的研究[138]及抗番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的植株的培育工作正在順利進(jìn)行中[81]。

此外，在利用CRISPR技術(shù)對大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）的研究取得成功后，已開始在番茄和馬鈴薯晚疫?。ㄒ环N毀滅性的病害）病原菌致病疫霉（P.infestans）中建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)[139]。并成功在四倍體馬鈴薯中鑒定出提高馬鈴薯晚疫病抗性的基因（StDMR6-1和StCHL1），使馬鈴薯的抗性育種得以突破[140]。

4?CRISPR技術(shù)在應(yīng)用過程中存在的問題

如今，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用十分廣闊[76]，已成為實現(xiàn)提高作物的產(chǎn)量、持續(xù)抗性及優(yōu)良品質(zhì)等育種目標(biāo)的重要工具[43，56，75]。盡管如此，現(xiàn)階段CRISPR技術(shù)在應(yīng)用過程中仍存在很多問題，主要包括：（1）還有許多植物由于有效遺傳轉(zhuǎn)化體系難以建立而無法開展大規(guī)模 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的研究[13，25];（2）雖然對許多植物，特別是農(nóng)作物的全基因組測序工作現(xiàn)在已經(jīng)完成。然而，決定許多重要性狀的主效基因仍尚未發(fā)現(xiàn)或得到鑒定，這限制了 CRISPR/Cas9 技術(shù)在植物基因工程育種中的應(yīng)用[39，42，141];（3）CRISPR系統(tǒng)對PAM序列的要求嚴(yán)格導(dǎo)致可以編輯的序列數(shù)較低、來源不同的Cas9基因和不同的靶位點導(dǎo)致突變效率不同[59，62，142]、植物中同源重組（homologous recombination，HR）的效率很低、這些因素都在一定程度上限制基因組的編輯效率[123];（4）存在脫靶現(xiàn)象，靶位點專一性有待提高[143-144];（5）目前的研究主要集中在利用CRISPR/ Cas9 技術(shù)破壞靶基因的功能上。而對如何利用 HDR（homology-directed repair，同源定向修復(fù)） 在基因組靶位點引入相關(guān)功能基因的研究較少，使得一些應(yīng)用的預(yù)期受到阻礙，如基因替換和大規(guī)模染色體缺失的基因工程[78-79];（6）突變植株在自然環(huán)境條件下的表現(xiàn)仍具有不確定性，不能直接在自然環(huán)境中獲得經(jīng)過基因組編輯的植物;（7）由于在使用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯作物基因組時仍需要借助轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段，且突變植株在自然環(huán)境條件下的表現(xiàn)仍具有不確定性，而對該技術(shù)是否屬于轉(zhuǎn)基因范疇以及是否應(yīng)該按照轉(zhuǎn)基因的管理辦法來進(jìn)行監(jiān)管仍具有爭議[14，16]。

5?展望

從目前的研究來看，CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用較其他基因編輯技術(shù)更廣泛主要得益于：（1）靶位點具有廣泛性：CRISPR/Cas9編輯技術(shù)所需的具有NGG的PAM序列的靶位點，在基因組中廣泛存在，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用廣泛[60，70，151];（2）靶位點特異性高：在單子葉模式植物——水稻中的脫靶率低，在雙子葉模式作物——擬南芥和煙草中沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象[78，144];（3）載體組裝過程簡便;（4）遺傳編輯之后不會造成外源基因污染現(xiàn)象，提高了人們對“煙草”等因為國際貿(mào)易限制而不允許轉(zhuǎn)基因作物的接受程度[54，57，150];（5）由于雙元載體T-DNA結(jié)構(gòu)的存在，可實現(xiàn)同時對多個基因位點的編輯;（6）由CRISPR介導(dǎo)的植物抗病基因改良在某些情況下對多種病原體具有廣譜抗性[37，152];（7）通過CRISPR系統(tǒng)作用產(chǎn)生抗性的植物不僅僅局限于試驗研究及溫室，一些CRISPR作物品種已開始商業(yè)化，如：含強(qiáng)化歐米伽-3油的亞麻薺（Camelina sativa （L.） Crantz）已進(jìn)入美國市場[2，67，149];（8）CRISPR/Cas9技術(shù)在基因表達(dá)調(diào)控，表觀遺傳學(xué)、基因座定位和染色體結(jié)構(gòu)研究及基因功能篩選等方面的研究中也可發(fā)揮重要作用。

此外，該技術(shù)在其他（植物技術(shù)方面也顯示出良好的應(yīng)用前景。例如，采用新生分生組織編輯雙子葉植物的基因可省略耗時的組織培養(yǎng)步驟[146];使用耐溫CRISPR/LbCas12a可以提高靶向性和突變效率，實現(xiàn)在水稻基因組中精確插入DNA序列[81];應(yīng)用熱誘導(dǎo)CRISPR系統(tǒng)可以提高玉米基因識別靶標(biāo)的效率[82];由Cas9蛋白的兩個切割結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變與sgRNA形成復(fù)合物，具有RNA干擾的作用[8]等。當(dāng)然，目前關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍有許多亟待解決的問題，為使其得到更好的應(yīng)用，研究者已開始著手進(jìn)行解決。例如，CRISPR技術(shù)在基因編輯方面存在的脫靶和靶位點專一性較低的問題[147]。目前已經(jīng)有專業(yè)的軟件，如Cas-OFFinder、SureDesign（由安捷倫公司開發(fā)）等，用于尋找 CRISPR/Cas9靶位點、設(shè)計sgRNA[148]。還可根據(jù)各種影響因素對突變頻率的影響，提示軟件用戶避開可能脫靶的位點、選擇突變效率較高的位點[149，153]。由病毒誘導(dǎo)的 CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)的開發(fā)，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶率大幅度較低。作為一種新的基因組編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)正在面對著全球糧食生產(chǎn)的危機(jī)，目前大量糧食作物的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性育種發(fā)展已進(jìn)入瓶頸期，是機(jī)遇也是巨大的挑戰(zhàn)。隨著越來越多的研究人員和實驗室的加入，CRISPR/Cas9 技術(shù)將在這個充滿各種挑戰(zhàn)和誘惑的后基因組時代變得更加有用，在未來得到更廣泛的應(yīng)用。

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