擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SSR序列特征分析

劉靖 魏俞虹 肖榕

摘 要：擬環(huán)紋豹蛛Pardosa pseudoannulata是稻田害蟲重要的自然天敵，在綠色防控中有重要作用。本研究基于擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用微衛(wèi)星鑒定工具軟件（MISA） 挖掘和分析其簡單序列重復(fù)（SSR）位點。結(jié)果表明：擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組Unigene序列中共檢測到6474個SSR位點，平均長度為12.36 bp，分布于4411條Unigene上。單核苷酸重復(fù)類型為擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR位點的主導基序類型，共5025個，占總SSR位點的77.62%;在擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組序列識別的6474個SSR中共發(fā)現(xiàn)了53種重復(fù)基元，從單核苷酸到五核苷酸重復(fù)基元分別有2種、6種、27種、15種和3種，其中（A/T）基元類型占明顯優(yōu)勢，占總SSR的74.44%。擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR位點豐富，有較高的多態(tài)性潛能，可作為開發(fā)SSR標記的有效來源，為擬環(huán)紋豹蛛的遺傳多樣性分析、功能基因的開發(fā)利用等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬環(huán)紋豹蛛;轉(zhuǎn)錄組;SSR;重復(fù)基元

中圖分類號：Q346+.5;Q959.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）04-0031-07

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.005

Abstract：The wolf spider Pardosa pseudoannulata is an important biological control agent of rice pests and plays an important role in green prevention and control.In this study，based on the transcriptome data of P.pseudoannulata，we used MISA （microsatellite identification tool） to analyze its SSR （simple sequence repeat） loci.The results showed that a total of 6474 SSR loci were detected in the Unigene sequence of the transcriptome data，with an average length of 12.36 bp，distributed on 4411 Unigenes.The Mono-nucleotide repeat type were the dominanttype，its number was 5025，accounting for 77.62% of the total SSR loci.The 6474 SSR lociwere identified 53 repetitive motifs，there were 2，6，27，15 and 3 repetitive motifs from Mono-nucleotide to Hexa-nucleotide.（A/T）was dominant repetitive motif，accounting for 74.44% of the total SSR.The SSR loci of transcriptome in P.pseudoannulata were rich and high polymorphism potential. Our results can be used as an effective source for the development of SSR marker and provide foundation for research of genetic diversity and development functional genes of P.pseudoannulata.

Keywords：Pardosa pseudoannulata;transcriptome;SSR;repeat motif

擬環(huán)紋豹蛛Pardosa pseudoannulata屬于蛛形綱Arachnida蜘蛛目Araneae狼蛛科Lycosidae豹蛛屬Pardosa，在我國分布較廣，是稻田生態(tài)系統(tǒng)中優(yōu)勢種蜘蛛，尤其在我國南方的廣東[1]、湖南[2]、湖北[3]、云南[4]、貴州[5]等地區(qū)常年可見。擬環(huán)紋豹蛛屬于中型蜘蛛，成蛛體長可達到13 mm，雌雄蛛均可多次交配，雌蛛每次平均產(chǎn)卵156粒，孵化的幼蛛群集在雌蛛背面3～7 d后才離開，幼蛛期47～158 d，成蛛期121～236 d，雌蛛較雄蛛長21～62 d[2，6-7]。擬環(huán)紋豹蛛是稻田害蟲的重要捕食性天敵，其空間生態(tài)位寬[6，8]，能夠在水面、稻株上、地面上等多種環(huán)境捕食褐飛虱Nilaparvata lugens、白背飛虱Sogatella furcifera、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、黑尾葉蟬Nephotettix bipunctatus等害蟲。在稻田中捕食飛虱和葉蟬，90%是狼蛛科蜘蛛的功勞[9-13]。擬環(huán)紋豹蛛的性情兇猛，專捕活蟲，即使飽食，也會把獵物咬死后才休止，食量也大，2齡幼蛛每頭每天平均捕食黑腹果蠅Drosophila melanogaster 4.36頭，成蛛每頭每天捕食水蠅Hydrellia sp.可達30頭[8，14]，雌成蛛對亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis 2齡幼蟲的捕食上限為116頭[15]，王智等[16]研究表明低劑量農(nóng)藥對擬環(huán)紋豹蛛捕食褐飛虱的能力有增強作用。本課題組前期對擬環(huán)紋豹蛛的求偶交配行為[17]、選擇行為[18]和溫度脅迫[19-20]和SNP位點[21]等方面進行了研究。目前，擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR位點分析未見報道。

微衛(wèi)星（microsatellite），又稱為簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR），是指以1～6個核苷酸為重復(fù)單元串聯(lián)組成的重復(fù)序列，串聯(lián)重復(fù)10～60次組成的簡單重復(fù)序，微衛(wèi)星具有高多態(tài)性、共顯性、高可重復(fù)性、數(shù)量豐富等優(yōu)點[22-23]。因此，微衛(wèi)星在遺傳分析中可以作為一種理想的分子標記，已被廣泛應(yīng)用于生物遺傳研究中，在苦蕎Fagopyrum tartaricum[24]、密花香薷Elsholtzia densa[25]、密葉紅豆杉Taxus fuana[26]、金佛山方竹Chimonobambusa utilis[27]等植物;麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana[28]、蚜蟲[29]、小胸鱉甲Microdera punctipennis[30]、桔小實蠅Bactrocera dorsalis[31]、溝渠豹蛛Pardosa laura[32]等動物中進行了報道。本文基于擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對其SSR特征進行分析，旨在為SSR標記在該物種的遺傳多樣性分析、功能基因的開發(fā)利用等方面提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

擬環(huán)紋豹蛛的亞成蛛采集于廣州市華南農(nóng)業(yè)大學試驗田（113.7°E，23.17°N）。亞成蛛采回后單頭放入玻璃試管（ 長100 mm，直徑25 mm） 中飼養(yǎng)，試管底部用一塊蘸水的海綿保濕，管口塞有海綿塞，防止蜘蛛逃逸，置于人工氣候箱內(nèi)（25±0.5）℃，相對濕度RH為60%±10%，光周期為14 L：10 D飼養(yǎng)。每周飼喂2次，每次飼喂4～6頭活家蠅Musca domestica成蟲，同時給試管底部的海綿添加足量的水以保持濕潤。每隔1 d觀察記錄擬環(huán)紋豹蛛蛻皮及成熟情況，成熟兩周后的蜘蛛用液氮速凍后置-80 ℃冰箱備用。

1.2?SSR位點的檢測

當蜘蛛成熟14 d后，使用TRIzol試劑盒提取蜘蛛的總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測合格的樣品，送北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina HiseqTM 2500平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果用Trinity軟件進行數(shù)據(jù)組裝獲得Unigene。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）軟件對擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組中的Unigene進行SSR位點檢測。檢測的重復(fù)序列從單堿基重復(fù)至六堿基重復(fù)，篩選參數(shù)：單核苷酸序列重復(fù)次數(shù)不低于10次，二核苷酸序列重復(fù)次數(shù)不低于6次，三核苷酸序列、四核苷酸序列、五核苷酸序列和六核苷酸序列重復(fù)次數(shù)則不低于5次。若2個SSR間距小于100 bp，則組成一個復(fù)合SSR位點。

2?結(jié)果與分析

2.1?擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組分布概況

組裝后的擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得67 725條Unigene，篩選長度1 kb以上的13 762條Unigene，利用MISA軟件分析發(fā)現(xiàn)，SSR重復(fù)序列總共有6474個，分布在4411條Unigene上，擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組Unigene序列平均每4581 bp就出現(xiàn)一個SSR位點。包含1個以上SSR位點數(shù)的Unigene數(shù)目1347條（表1）。可見，擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組所包含SSR位點較豐富，且分布較廣泛。

2.2?擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR位點不同重復(fù)類型分析

對擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組搜索的SSR位點進行了核苷酸重復(fù)類型分類，共有5種重復(fù)類型（表2）。不同重復(fù)類型形成的SSR位點數(shù)目相差較大，其中單核苷酸重復(fù)位點最多，為5025個，占總SSR位點的77.62%，總長度為62 117 bp，平均每477 bp出現(xiàn)1個單核苷酸重復(fù)序列，單核苷酸平均長度為12.36 bp;二核苷酸重復(fù)SSR位點，為985個，占總SSR位點的15.21%，總長度為13 868 bp，平均每2138 bp出現(xiàn)1個二核苷酸重復(fù)序列，二核苷酸平均長度為14.08 bp;三核苷酸重復(fù)SSR位點，為421個，占總SSR位點的6.50%，總長度為6918 bp，平均每4287 bp出現(xiàn)1個三核苷酸重復(fù)序列，三核苷酸平均長度為16.43 bp;四核苷酸重復(fù)SSR位點，為40個，占總SSR位點的0.62%，總長度為824 bp，平均每35 990 bp出現(xiàn)1個四核苷酸重復(fù)序列，四核苷酸平均長度為20.60 bp;五核苷酸重復(fù)SSR位點最少，為3個，占總SSR位點的0.05%，總長度為90 bp，平均每329 506 bp出現(xiàn)1個五核苷酸重復(fù)序列，五核苷酸平均長度為30.00 bp。不同重復(fù)類型形成SSR頻率差異較大，其中單核苷酸重復(fù)類型SSR發(fā)生頻率最高，每100條Unigene有36.51個SSR位點出現(xiàn);五核苷酸重復(fù)類型SSR發(fā)生頻率最低，100條Unigene僅有0.02個SSR位點出現(xiàn)（表2）。

2.3?擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型分析

在擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組序列識別的6474個SSR中共發(fā)現(xiàn)了53種重復(fù)基元，其中單核苷酸重復(fù)基元有2種、二核苷酸重復(fù)基元有6種、三核苷酸重復(fù)基元有27種、四核苷酸重復(fù)基元有15種、五核苷酸重復(fù)基元有3種。不同基元類型形成SSR位點數(shù)目存在差異，從總體來看，隨著SSR基元堿基數(shù)目的增加，SSR位點數(shù)呈下降趨勢。其中單核苷酸基元（A/T）發(fā)生頻率最高為35.02%，其次是（AT/AT）的2.81%、（TA/TA）的2.03%、（C/G）的1.50%、（AC/GT）的0.80%等（表3）。

在單核苷酸重復(fù)基元中，（A/T）基元類型占明顯優(yōu)勢，共形成4819個SSR位點，占單核苷酸SSR位點的95.90%，總SSR位點的74.44%，屬于單堿基的優(yōu)勢重復(fù)基元（圖1，表3）。在二核苷酸重復(fù)基元中（AT/AT）和（TA/TA）基元類型占明顯優(yōu)勢。（AT/AT）基元類型共形成387個SSR位點，占二核苷酸SSR位點的39.29%，占總SSR位點的5.98%;其次是（TA/TA）基元類型，共形成280個SSR位點，占二核苷酸SSR位點的28.43%，占總SSR位點的4.32%（圖1，表3）。在三核苷酸重復(fù)基元中（AAT/ATT）、（TCA/TGA）、（TAA/TTA）基元類型占明顯優(yōu)勢。（AAT/ATT）基元類型形成46個SSR位點，占三核苷酸SSR位點的10.93%，占總SSR位點的0.71%;（TCA/TGA）基元類型形成39個SSR位點，占三核苷酸SSR位點的9.26%，占總SSR位點的0.60%;（TAA/TTA）基元類型形成37個SSR位點，占三核苷酸SSR位點的8.79%，占總SSR位點的0.57%（圖1，表3）。在四核苷酸重復(fù)基元中（TAAA/TTTA）和（AAAT/ATTT）基元類型占明顯優(yōu)勢。（TAAA/TTTA）基元類型共形成8個SSR位點，占四核苷酸SSR位點的20.00%，占總SSR位點的0.12%;其次是（AAAT/ATTT）基元類型，共形成7個SSR位點，占四核苷酸SSR位點的17.50%，占總SSR位點的0.11%（圖1，表3）。在五核苷酸重復(fù)基元中（AACCT/AGGTT）、（TTTTA/TAAAA）、（ATATA/TATAT）基元類型，每一種類型都只形成1個SSR位點，占五核苷酸SSR位點的33.33%，占總SSR位點的0.02%（圖1，表3）。

2.4?擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)分析

擬環(huán)紋豹蛛SSR基元重復(fù)次數(shù)在不同基元類型間存在差異，不同重復(fù)次數(shù)所形成的SSR位點差異較大，每種類型構(gòu)成的SSR位點中，最小重復(fù)次數(shù)的SSR位點最多，且隨著基元堿基數(shù)目的增加，重復(fù)次數(shù)類型呈下降趨勢（圖2）。單核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)類型最多，共有15種重復(fù)次數(shù)，不同重復(fù)次數(shù)所形成的SSR位點數(shù)量差異較大，最小重復(fù)次數(shù)為10次，形成2210個SSR位點，占單核苷酸SSR位點的43.98%，最大重復(fù)次數(shù)為24次，僅形成1個SSR位點，占單核苷酸SSR位點的0.02%。二核苷酸重復(fù)基元共有8種重復(fù)次數(shù)類型，其中最小重復(fù)次數(shù)為6次（505個，51.26%），最大重復(fù)次數(shù)為13次（1個，0.10%）。三核苷酸重復(fù)基元共有6種重復(fù)次數(shù)類型，其中最小重復(fù)次數(shù)為5次（278個，66.03%），最大重復(fù)次數(shù)為10次（1個，0.24%）。四核苷酸重復(fù)基元共有2種重復(fù)次數(shù)類型，最小重復(fù)次數(shù)為5次（34個，85%），最大重復(fù)次數(shù)為6次（位點數(shù)：6個，15%）。五核苷酸重復(fù)基元的共有3種重復(fù)次數(shù)類型，其中最小重復(fù)次數(shù)為5次（1個，33.33%），最大重復(fù)次數(shù)為7次（1個，33.33%）。

2.5?擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR長度分析

影響SSR多態(tài)性的主要因素是SSR序列的長度，SSR序列長度與其多態(tài)性成正比。SSR序列長度<12 bp時，SSR多態(tài)性很低;12 bp≤SSR序列長度<20 bp時，SSR多態(tài)性良好;SSR序列長度≥20 bp時，SSR多態(tài)性較高[27，33]。對擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR長度進行分析，SSR長度在10～35 bp之間，平均長度為12.95 bp（表2，圖3）。其中數(shù)量最多的SSR序列長度為12～19 bp，占比為47.28%;其次是長度小于12 bp SSR序列，占比為46.18%;然后是SSR序列長度為20～35 bp，占比為6.53%，總體來看，SSR多態(tài)性屬于良好（圖3）。

3?結(jié)論與討論

本研究基于擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得67 725條Unigene，篩選長度1 kb以上的13 762條Unigene，利用MISA軟件共檢測到6474個SSR位點，分布于4411條Unigene上，SSR出現(xiàn)頻率為47.04%。擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率明顯高于荔枝蒂蛀蟲Conopomorpha sinensis（15.25%）[34]、印度谷螟Plodia interpunctella（8.52%）[35]、小胸鱉甲M.punctipennis（7.94%）[30]、麥紅吸漿蟲S.mo-sellana（3.49%）[28]等昆蟲。不同物種間SSR位點出現(xiàn)頻率的差異，可能是與不同物種基因組特點有關(guān)，也可能和測序深度、篩選SSR的軟件及檢測時選擇的參數(shù)等因素有關(guān)。如，本研究與溝渠豹蛛P.laura（80.11%）[32]的研究相比，研究對象都屬于豹蛛屬蜘蛛，設(shè)定參數(shù)也相同，均是對大于1 kb的Unigene進行SSR搜索，但檢測到的SSR數(shù)量和SSR出現(xiàn)的頻率存在明顯的差異。

擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組搜索的SSR位點進行了核苷酸重復(fù)類型分類，共有5種重復(fù)類型，單核苷酸重復(fù)位點為5025個、二核苷酸重復(fù)SSR位點為985個、三核苷酸重復(fù)SSR位點為421個、四核苷酸重復(fù)SSR位點為40個、五核苷酸重復(fù)SSR位點為3個。擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR位點的主導基序類型是單核苷酸重復(fù)類型，占總SSR位點的77.62%，高于馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata（63.23%）[36]、梨網(wǎng)蝽Stephanitis nashi（40.41%）[37]、麥紅吸漿蟲S.mosellana（37.07%）[28]、小胸鱉甲M.punctipennis（47.17%）[30]等昆蟲，與溝渠豹蛛P.laura（72.67%）[32]相差不大，低于窄足真蚋Simulium（Eusimulium）angustipes（87.05%）[38]。擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)了53種重復(fù)基元，從單核苷酸到五核苷酸重復(fù)基元分別有2種、6種、27種、15種和3種，其中單核苷酸（A/T）基元類型占總SSR的74.44%，占明顯優(yōu)勢，這與溝渠豹蛛P.laura[32]、馬鈴薯甲蟲L.decemlineata[36]、麥紅吸漿蟲S.mosellana[28]、小胸鱉甲M.punctipennis[30]等轉(zhuǎn)錄組SSR分析研究結(jié)果相似。二核苷酸重復(fù)基元中，（AT/AT）是優(yōu)勢基元，分別占總SSR的5.98%，這與溝渠豹蛛P.laura[32]分析研究結(jié)果相似。但在擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組SSR中，不含二核苷酸重復(fù)基元（GC/CG），這與桔小實蠅B.dorsalis[31]及褐飛虱N.lugens[39]的研究結(jié)果相似，（GC/CG）是非常稀有的重復(fù)基元，其數(shù)量幾乎接近零，推測（GC/CG）重復(fù)基元在不同物種的基因組中都可能是相當稀有的SSR。三核苷酸重復(fù)基元中，（AAT/ATT）基元占優(yōu)勢，與褐飛虱（AAG/CTT）[39]、麥紅吸漿蟲（AAC/GTT）[28]、小胸鱉甲（CCG/GCC）[30]不同，與溝渠豹蛛[32]相同，（AAT/ATT）基元占優(yōu)勢，可能是由于高滑變率及其作為終止密碼子的延伸區(qū)引起的[40]。

綜上所述，本研究基于擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到其SSR位點信息，對不同類型位點的數(shù)量、比例、頻率與重復(fù)次數(shù)，以及對不同的重復(fù)基元類型的數(shù)量和比例等進行了分析，以期為研究擬環(huán)紋豹蛛的遺傳多樣性分析、功能基因的開發(fā)利用等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

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