重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)PGA的條件優(yōu)化

羅 倩，黎繼烈，王 衛(wèi)，郭 璐，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004）

重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)PGA的條件優(yōu)化

羅 倩，黎繼烈，王 衛(wèi)，郭 璐，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004）

對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)青霉素G酰化酶(PGA)的培養(yǎng)條件進(jìn)行探討。依據(jù)基礎(chǔ)鹽搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了接種量、甘油濃度、pH以及誘導(dǎo)過(guò)程中氨水濃度、甲醇濃度等因素對(duì)PGA表達(dá)的影響。并采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行因素組合優(yōu)化。結(jié)果與意義：最佳發(fā)酵條件為：甘油濃度40 g/L、氨水濃度0.1%、甲醇濃度1.0%、pH 5.6、接種量10%，在此條件下PGA酶活力達(dá)到8 680±12 U/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)下一步利用發(fā)酵罐進(jìn)行重組畢赤酵母擴(kuò)大培養(yǎng)有借鑒作用。

畢赤酵母；青霉素G?；福慌囵B(yǎng)條件優(yōu)化；Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

青霉素G?；? Penicillin G Acylase，EC 3. 5. 1.11，簡(jiǎn)稱PGA)是用于抗生素中間體6-氨基頭孢烷酸(6-APA)和7-氨基脫乙酰頭孢烷酸(7-ADCA)生產(chǎn)的重要酶制劑，目前已經(jīng)在工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。許多微生物均可以產(chǎn)生青霉素酰化酶，這包括細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母等[3-4]。近年來(lái)，青霉素?；傅陌l(fā)展主要是在以下2個(gè)方面：一是運(yùn)用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法尋找該酶的高產(chǎn)菌株和性能優(yōu)良菌株；二是探索新的高效的固定化方法，提高酶固定化效率和使用穩(wěn)定性，改善酶的應(yīng)用特性。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)有著近年發(fā)展起來(lái)的一種高效表達(dá)外源蛋白的真核系統(tǒng)，其有諸多優(yōu)點(diǎn)[5-6]：外源基因穩(wěn)定、目的蛋白表達(dá)量高、分泌效率高、并具有甲醇精確調(diào)控的醇氧化酶啟動(dòng)子PAOX及日臻成熟的高密度發(fā)酵工藝。如今已用這個(gè)系統(tǒng)成功的表達(dá)了200種以上蛋白，包括病毒的、細(xì)菌的、真菌的、動(dòng)植物和某些人體蛋白[7]。到目前為止，文獻(xiàn)中有關(guān)畢赤酵母產(chǎn)胞內(nèi)PGA的報(bào)道較少，筆者采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)重組巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，以期得到高產(chǎn)PGA的發(fā)酵條件，從而為PGA工業(yè)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[8]。

1 材料與方法

1.1 菌 株

畢氏酵母工程細(xì)胞株，由中南林業(yè)科技大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基，BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，以及PTM1配方均采用Invitrogen公司提供的標(biāo)準(zhǔn)配方。BSM需高壓滅菌后再加4.0 mL/L過(guò)濾除菌的PTM1[9]。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子擴(kuò)大搖瓶培養(yǎng)

50 mL種子培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，滅菌冷卻后，于無(wú)菌狀態(tài)下吸取0.5～1.0 mL甘油管菌液，于30 ℃，220 r/min下，培養(yǎng)40 h。

1.3.2 畢赤酵母搖瓶發(fā)酵

將培養(yǎng)好的種子液以10%接種量接種到預(yù)裝80 mL BSM基礎(chǔ)鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r/min下培養(yǎng)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1%，每隔12 h補(bǔ)加28%氨水至終濃度0.1%，維持培養(yǎng)基中pH值5.5左右，同時(shí)亦可補(bǔ)加氮源，培養(yǎng)120 h后，發(fā)酵結(jié)束。同一水平3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 酶活測(cè)定方法

酶活測(cè)定采用堿滴定法[10]。

1.5 中心組合實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定中心組合實(shí)驗(yàn)的因素與水平，進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分析，最終確定重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)PGA培養(yǎng)的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 甘油濃度對(duì)PGA表達(dá)水平的影響

在其它發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分不變的情況下，甘油按 30、35、40、45、50 g/L比例加入，誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后，測(cè)PGA活力。從圖1中可以看出，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度增高時(shí)，菌體產(chǎn)PGA表達(dá)水平也隨之升高，但當(dāng)甘油濃度大于40 g/L時(shí)，PGA表達(dá)水平卻隨甘油濃度升高而減少，說(shuō)明甘油濃度過(guò)低或過(guò)高會(huì)限制或抑制菌體表達(dá)PGA。而甘油濃度為40 g/L時(shí)重組畢赤酵母PGA表達(dá)水平最高，達(dá)到8 319 U/L。

圖1 甘油濃度對(duì)PGA表達(dá)水平的影響Fig.1 Effects of glycerol concentration on PGA activity

2.1.2 氨水濃度對(duì)PGA表達(dá)水平的影響

補(bǔ)料用的28%氨水預(yù)先經(jīng)過(guò)濾除菌，氨水加入量按體積百分比計(jì)算分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%，每隔12 h補(bǔ)加1次。誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后，測(cè)PGA活力。從圖2中可以看出，隨著氨水體積分?jǐn)?shù)增高，PGA酶活也隨之升高；當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)等于0.1% 時(shí)，PGA酶活達(dá)到8 296 U/L；而當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)大于0.1% 時(shí)，PGA酶活卻隨之下降，說(shuō)明過(guò)高的氨水體積分?jǐn)?shù)不利于畢赤酵母的PGA表達(dá)，所以本實(shí)驗(yàn)選取每12 h補(bǔ)加28%氨水至0.1%。

圖2 氨水濃度對(duì)PGA表達(dá)水平的影響Fig.2 Effects of ammonia water concentration on PGA activity

2.1.3 甲醇濃度對(duì)PGA表達(dá)水平的影響

以甲醇濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加甲醇維持以上濃度。誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h[11]后，測(cè)PGA活力。甲醇濃度過(guò)低，會(huì)限制菌體生長(zhǎng)和誘導(dǎo)強(qiáng)度；濃度過(guò)高，則對(duì)菌體產(chǎn)生毒性。從圖3中可以看出，最適甲醇濃度為1.0%，PGA表達(dá)水平達(dá)到8 448 U/L；濃度超過(guò)1.5% 時(shí)，甲醇對(duì)菌體PGA表達(dá)水平有抑制作用。

圖3 甲醇濃度對(duì)PGA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of methanol concentration on PGA activity

2.1.4 pH對(duì)PGA表達(dá)水平的影響

配制不同pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后，測(cè)PGA活力。由于外界的pH值變化會(huì)改變菌體細(xì)胞內(nèi)的pH值，從而影響細(xì)菌的代謝反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物量和基因產(chǎn)物的表達(dá)[12]。從圖4中可以看出，最適pH值為5.5，此時(shí)的PGA表達(dá)水平達(dá)到8 402 U/L。

圖4 pH值對(duì)PGA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of pH on PGA activity

2.1.5 接種量對(duì)PGA表達(dá)水平的影響

試驗(yàn)不同的接種量對(duì)畢赤酵母表達(dá)PGA的影響，接種量大小的控制在很多細(xì)胞培養(yǎng)和代謝物積累中都發(fā)揮著重要作用[13]。分別以4%、6%、8%、10%、12%的接種量接種到BSM基礎(chǔ)鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)接種量為10% 時(shí)，此時(shí)的PGA表達(dá)水平達(dá)到8 511 U/L。

圖5 接種量對(duì)PGA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of inoculum on PGA activity

2.2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察甲醇體積百分比（X1）、氨水體積百分比（X2）和培養(yǎng)基pH值（X3）這3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值Y（PGA酶活力）的影響，各個(gè)因素的水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

利用SAS.8.1軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=8692.33+31.62X1-61.563X2+182.50X3-284.00X1X2+136.75X1X3-73.25X2X3-1 105.67X12-778.17X22-1 123.42X32

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.1 二次回歸擬合及方差分析

對(duì)SAS軟件擬合所得方程進(jìn)行分析，表3為對(duì)該擬合方程進(jìn)行方差分析的結(jié)果，表4為回歸方程系數(shù)顯著性的檢驗(yàn)結(jié)果。在回歸方程中，是通過(guò)F檢驗(yàn)來(lái)判定各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性的，當(dāng)其概率P的值越小時(shí)，則相應(yīng)變量的顯著程度就越高。表3中的模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著，而其校正決定系數(shù)R2Adj=0.947 7，表明總變異中僅有5.23%是不能由該模型來(lái)進(jìn)行解釋。相關(guān)系數(shù)R2= 0.981 3以及Lack of Fit值(0.101 8＞0.05)，表明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，回歸方程是能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

從表4中可以看出，在實(shí)驗(yàn)的水平范圍內(nèi)顯著(P＜0.05)的因素為交互項(xiàng)XX以及二次項(xiàng)X2、

121X2

2和X32。對(duì)這一現(xiàn)象的可能解釋是，畢赤酵母在以甲醇作為誘導(dǎo)物及碳源，合成PGA過(guò)程中，需通過(guò)呼吸作用產(chǎn)能及相應(yīng)的還原力NADPH，此過(guò)程中釋放出來(lái)H+部分溶于培養(yǎng)基后pH偏酸；而PGA的合成過(guò)程中需要構(gòu)建酰胺鍵，隨著氨水的補(bǔ)料加入，環(huán)境pH會(huì)上升，故X1與X2兩因素交互作用明顯。試驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，pH跨度為5.0～6.0以及發(fā)酵培養(yǎng)基中緩沖液系統(tǒng)的存在，此時(shí)培養(yǎng)基中由于細(xì)胞的新陳代謝甲醇快速消耗，而酶的合成相對(duì)緩慢，所表現(xiàn)出來(lái)的是pH與甲醇、氨水補(bǔ)料的相互作用相對(duì)較弱。去除非顯著性因素后，重組畢赤酵母產(chǎn)PGA發(fā)酵各因素的二次多項(xiàng)回歸方程式可簡(jiǎn)略為：

Y=8 692.33-284.00X1X2-1 105.67X12-778.17X22-1 123.42X23

進(jìn)一步優(yōu)化分析可知，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)為極大值。對(duì)所得的回歸擬合方程進(jìn)行偏導(dǎo)微分處理得到X1、X2和X3的最佳取值：X1＝0.026、X2＝ -0.048、X3＝ 0.085，即甲醇流加體積比為1.01%、氨水補(bǔ)加體積比為0.10%、培養(yǎng)基pH為5.64，在此條件下表達(dá)PGA，回歸方程預(yù)測(cè)的PGA活力為8 701.92 U/L。為實(shí)驗(yàn)操作方便，取最優(yōu)條件為甲醇補(bǔ)加體積比1.0%、氨水補(bǔ)加體積比為0.10%、培養(yǎng)基pH值為5.6。

表 3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸方程方差分析?Table 3 Variance analysis of response surface regression

2.3 回歸模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，以上述求得的最佳取值下進(jìn)行重組畢赤酵母PGA表達(dá)水平的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)5次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得PGA的平均活力為8 680±12 U/L，與理論預(yù)測(cè)值相比誤差為0.25%。范超等[8]采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法，對(duì)重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅陌l(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，由于重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)胞外PGA，胞外酶在發(fā)酵過(guò)程中被分泌到發(fā)酵液中，便于酶活力的測(cè)定，該實(shí)驗(yàn)的研究方向?qū)Ρ菊n題有一定的借鑒作用。此外，作為產(chǎn)胞內(nèi)PGA的畢赤酵母工程菌，在甘油消耗完后，需補(bǔ)料甲醇，此時(shí)細(xì)胞以甲醇為唯一碳源并誘導(dǎo)細(xì)胞代謝產(chǎn)酶，細(xì)胞進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)階段。在誘導(dǎo)表達(dá)階段，補(bǔ)料量的控制也至關(guān)重要，因?yàn)榧状蓟虬彼绕浼状嫉倪^(guò)量會(huì)嚴(yán)重毒害酵母細(xì)胞，從而會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵失敗[14-16]。

表 4 回歸系數(shù)顯著性分析Table 4 Significant analysis of regression coefficients

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)PGA的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵條件為：甘油濃度40 g/L、氨水濃度0.1%、甲醇濃度1.0%、pH 5.6、接種量10%，在此條件下PGA酶活力達(dá)到8 680±12 U/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)下一步利用發(fā)酵罐進(jìn)行重組畢赤酵母擴(kuò)大培養(yǎng)有借鑒作用，從而為PGA工業(yè)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions for expression of PGA in recombinant Pichia pastoris

LUO Qian, LI Ji-lie, WANG Wei, GUO Lu, ZHU Xiao-yuan
(School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The cultivation conditions for Penicillin G acylase (PGA) production by recombinant Pichia pastoris were studied. the inf l uences of inoculum, pH value, concentrations of glycerol, and methanol and ammonia water on the expression of PGA and the cell growth were investigated in shake fl asks with Fermentation Basal Salts Medium by single factor experiments. And the experiments with the Box-Behnken experimental design were conducted to optimize the fermentation conditions of PGA production of recombinant P.pastoris. The results and implications are as follows: the optimum fermentation conditions were obtained (glycerol concentration 40 g/L, ammonia water concentration 0.1%, methanol concentration 1.0%, pH 5.6, inoculum 10%). Under these conditions, the activity of PGA was (8 680±12) U/L. These results will be provide a reference base for the expansion cultivation of recombinant P. pastoris fermentation.

Pichia pastoris; Penicillin G acylation enzyme; cultural condition optimization; Box-Behnken experimental design

S718.8

A

1673-923X(2013)05-0101-04

2012-11-12

國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目（2011-4-17）

羅 倩（1988-），女，湖南岳陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镉N、微生物轉(zhuǎn)化及過(guò)程調(diào)控；

E-mail：luoqian7747@126.com

黎繼烈（1959-），女，湖南岳陽(yáng)人，教授，博士，博導(dǎo)，研究方向?yàn)槭称芳庸?；E-mail：lijilie@163.com

[本文編校：吳 毅]