RKIP表達(dá)下調(diào)對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科； 2 基礎(chǔ)學(xué)院病原微生物學(xué)教研室)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，盡管通過手術(shù)、放化療等治療，絕大多數(shù)病人預(yù)后較好，但一部分病人仍有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的可能性，且轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)后預(yù)后較差[1]。因此，盡早診斷轉(zhuǎn)移病灶并有效治療腫瘤是目前研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，某些基因雖然并不參與腫瘤的發(fā)生，但是其功能的喪失與原發(fā)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。因此，這些基因的研究對腫瘤診治有著新的意義。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)轉(zhuǎn)染成功后表達(dá)的抑制蛋白可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此成為了目前腫瘤學(xué)研究的新靶點(diǎn)[3]。已有研究證實(shí)，RKIP在多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2-3]，而目前關(guān)于其與宮頸癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究相對較少。為了進(jìn)一步揭示RKIP在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的作用，本文采用脂質(zhì)體法，用反義及空白RKIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌Caski細(xì)胞，建立RKIP表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，進(jìn)而研究RKIP表達(dá)下調(diào)對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

宮頸癌Caski細(xì)胞株來自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗室，采用含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的DMEM培養(yǎng)基，在適宜條件下培養(yǎng)。含有人全長RKIP基因的反義質(zhì)粒asRKIP、空白質(zhì)粒pcDNA3.1(-)，由美國密西根大學(xué)Evan T.Keller教授惠贈。DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；G418、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco公司)；羊抗人抗體(Abcam公司)；小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Transwell細(xì)胞小室(Corning公司)；鼠抗羊多克隆抗體(北京博奧森公司)；PVDF膜、ECL試劑盒(Amershan Pharmacia公司)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將Caski細(xì)胞接種于6孔板中，每孔(2～5)×105個細(xì)胞。第2天細(xì)胞達(dá)到約90%融合時，采用脂質(zhì)體法，分別將反義質(zhì)粒asRKIP和空白質(zhì)粒pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)入宮頸癌Caski細(xì)胞中。1 d后，將細(xì)胞按 1∶10傳代，用含G418的DMEM(質(zhì)量濃度為500 mg/L)篩選轉(zhuǎn)染后的兩種Caski細(xì)胞。10 d～2周后空白對照細(xì)胞Caski-(-)死亡后，選出G418抗性克隆細(xì)胞，用200 mg/L G418繼續(xù)培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Caski細(xì)胞系，分別命名為Caski-asRKIP和Caski-(-)。將asRKIP轉(zhuǎn)染后Caski細(xì)胞分為平行的兩組,分別命名為Caski-asRKIP#1細(xì)胞和Caski-asRKIP#2細(xì)胞。

1.2.2Western Blotting法檢測各細(xì)胞中RKIP蛋白的表達(dá) 取對數(shù)期的轉(zhuǎn)染后Caski-asRKIP和Caski-(-)細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用Bradford方法檢測總蛋白的濃度。取40 μg細(xì)胞總蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用脫脂牛奶常溫封閉2 h。用封閉液稀釋一抗 (羊抗人RKIP抗體1∶200稀釋，鼠抗人β-actin 1∶6 000稀釋)，用稀釋的一抗常溫溫育蛋白2 h；TBST緩沖液洗膜；二抗室溫溫育1 h；緩沖液洗膜3次，每次8 min；ECL試劑顯影和曝光檢測RKIP蛋白表達(dá)。采集圖像后使用Quantity One系統(tǒng)分析灰度值，比較RKIP蛋白表達(dá)差異。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力 將Caski-asRKIP、Caski-(-)和未轉(zhuǎn)染的Caski細(xì)胞接種于96孔板上，每孔細(xì)胞(3～8)×103個，每組5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)12、24、36、48、60和72 h后，分別加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h。倒掉培養(yǎng)液，分別加入 DMSO溶解。然后，測定各孔細(xì)胞的吸光度(A)值，計算各時間點(diǎn)的平均值，繪制生長曲線。重復(fù)實(shí)驗3次。

1.2.4軟瓊脂集落形成實(shí)驗 將7 g/L瓊脂糖溶液與2×DMEM培養(yǎng)基混合加入直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，室溫凝固備用(底層瓊脂)，然后制備含(1～3)×107/L細(xì)胞的頂層瓊脂，將頂層瓊脂鋪至底層瓊脂上，于室溫下凝固；然后將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。顯微鏡下觀察克隆團(tuán)，計數(shù)含多于60個細(xì)胞的克隆團(tuán),計算克隆形成的平均值,檢測宮頸癌細(xì)胞體外非依賴性生長的能力。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗檢測宮頸癌細(xì)胞體外侵襲能力 將預(yù)冷好細(xì)胞小室的濾膜上面涂趨化劑纖連蛋白，自然風(fēng)干；將經(jīng)過DMEM培養(yǎng)液稀釋的人工基底膜凝膠作用在濾膜上0.05 h，然后用PBS緩沖液沖洗；在24孔培養(yǎng)板中加入無血清的DMEM培養(yǎng)液(含1 g/L的血清清蛋白)，每孔加入600 μL；用DMEM培養(yǎng)液將Caski-asRKIP#1細(xì)胞、Caski-asRKIP#2細(xì)胞、Caski-(-)細(xì)胞及Caski細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液(密度為2×109/L)，每個小室內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液；將小室放到條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h左右，用緩沖液沖洗3～4次，中性甲醛溶液作用10 min，固定后經(jīng)蘇木精-伊紅染色，用刀片取下濾膜固定于載玻片上，顯微鏡下觀察視野中穿過濾膜的細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞系

在Caski-asRKIP#1細(xì)胞和Caski-asRKIP#2細(xì)胞中RKIP的表達(dá)水平明顯低于Caski-(-)細(xì)胞和Caski細(xì)胞(圖1)，成功地建立了RKIP表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宮頸癌Caski細(xì)胞。

2.2 宮頸癌細(xì)胞的體外增殖能力

Caski-asRKIP#1和Caski-asRKIP#2細(xì)胞的增殖速度均較Caski-(-)細(xì)胞和Caski細(xì)胞快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.98～6.43，P<0.05)，而Caski細(xì)胞和Caski-(-)細(xì)胞的增殖速度比較，差異無顯著性(t=1.36,P>0.05)。見圖2。

圖1 各組Caski細(xì)胞中RKIP的表達(dá)

圖2 各組Caski細(xì)胞的體外增殖能力

2.3 宮頸癌細(xì)胞的體外非依賴性生長

各組Caski細(xì)胞均可以在雙層瓊脂中增殖并形成集落，Caski-asRKIP#1細(xì)胞形成集落數(shù)為(180±10)個，Caski-asRKIP#2細(xì)胞形成集落數(shù)為(185±10)個，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Caski-(-)細(xì)胞形成集落數(shù)為(90±10)個，未轉(zhuǎn)染的Caski細(xì)胞形成集落數(shù)為(70±10)個。Caski-asRKIP#1和Caski-asRKIP#2細(xì)胞與Caski-(-)細(xì)胞、Caski細(xì)胞比較，形成的集落大且集落數(shù)目多，差異有顯著性(F=19.98，P<0.05)；Caski-(-)細(xì)胞和Caski細(xì)胞比較，差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 各組宮頸癌細(xì)胞的體外侵襲能力比較

各組宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力不同，其中Caski-asRKIP#1組穿過小室的細(xì)胞數(shù)為(220±10)個，Caski-asRKIP#2組為(210±10)個，兩組比較差異無顯著性(t=1.26,P>0.05)；Caski組細(xì)胞穿過侵襲小室膜的數(shù)目為(160±10)個，Caski-(-)細(xì)胞穿膜數(shù)目為(175±10)個,兩組穿過小室的細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.35,P>0.05)。Caski-asRKIP#1組和Caski-asRKIP#2組與Caski-(-)組、Caski組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.98，P<0.05)。

3 討 論

Raf激酶抑制蛋白屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族，是一種從牛腦組織中純化的胞漿蛋白，在脂代謝和磷脂膜生物合成等方面均可發(fā)揮作用，故命名為PRBP-1。1999年有研究結(jié)果顯示，此基因可以與Raf-1結(jié)合，特異性地抑制特定蛋白信號通路，將其稱為RKIP[2-3]。后來的研究結(jié)果顯示，RKIP還同時參與了對NF-κB信號通路及G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的調(diào)控[3]。近年來研究結(jié)果顯示，RKIP表達(dá)異常或其信號通路異常與多種惡性疾病密切相關(guān)，如前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌[4-9]，RKIP表達(dá)水平下調(diào)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。LI等[10-11]研究結(jié)果顯示，RKIP在婦科惡性腫瘤如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)下調(diào)，一定程度上可促進(jìn)婦科惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。關(guān)于原癌基因與婦科腫瘤的研究比較常見[12]，但是目前國內(nèi)外關(guān)于RKIP等抑癌基因與宮頸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究報道相對較少。

吳景麗等[13]采用免疫組化方法，對宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變及正常宮頸組織的RKIP表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中的RKIP表達(dá)水平低于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及正常宮頸組織；RKIP在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)。孟琴等[14]研究結(jié)果與其相同。但上述研究均采用免疫組織化學(xué)方法并且屬于回顧性分析，研究結(jié)果可信度較低。

本研究采用脂質(zhì)體法，將含有人全長RKIP基因的反義質(zhì)粒asRKIP及空白質(zhì)粒pcDNA3.1(-)分別轉(zhuǎn)入人宮頸癌細(xì)胞系Caski細(xì)胞中，并用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞，然后應(yīng)用Western Blotting方法檢測Caski細(xì)胞中RKIP的蛋白表達(dá)水平，采用MTT法、軟瓊脂集落形成實(shí)驗和Transwell小室體外侵襲實(shí)驗檢測RKIP表達(dá)下調(diào)對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞的增殖速度比空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞快，差異有顯著性；而空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞的增殖速度無明顯差異，證實(shí)轉(zhuǎn)染后RKIP表達(dá)下調(diào)的宮頸癌細(xì)胞體外增殖速度快，即RKIP表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。各組細(xì)胞均能在軟瓊脂中形成集落，反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski

細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞比較，形成的集落大且數(shù)量多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，證明RKIP表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)Caski細(xì)胞的體外非依賴性生長。在Transwell小室實(shí)驗中，反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞穿過細(xì)胞小室數(shù)目比空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，證實(shí)RKIP的表達(dá)下調(diào)對于宮頸癌細(xì)胞的體外侵襲能力有一定程度的影響。本研究結(jié)果證實(shí)了RKIP表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，為尋找抗腫瘤效果更強(qiáng)并對人體毒性作用更小的新藥物，改善宮頸癌病人的預(yù)后提供了新的參考。

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