金雀花堿的波譜特征與結(jié)構(gòu)確證

李文杰，張林軍，張冬梅，王瓊，何性順，杜姣姣

（西安近代化學(xué)研究所，西安，710065）

金雀花堿（化學(xué)名為1，5-喬亞甲基-8氫-吡啶并［1，2-α］［1，5］二氮芳辛-8-酮，分子式為：C11H14N2O，分子量為190.24）大多分布于豆科、小檗科植物中。野生植物披針葉黃華的種子及全草中含有大量此類生物堿，其極強(qiáng)的生物活性從上世紀(jì)70年代起就引起了人們關(guān)注。金雀花堿類似煙堿，能反射性地興奮呼吸，是一種臨床上用于抗心律失常的生物堿類藥物。近年來，金雀花堿作為療效確切的戒煙制劑原料引起國際醫(yī)藥界的關(guān)注，研究表明，以金雀花堿的酒石酸鹽為主要成分的戒煙制劑的一年期戒煙有效率可達(dá)22%，具有可觀的發(fā)展前景［1-5］。

國內(nèi)對其結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究很少，對其完整的結(jié)構(gòu)解析尚未見報道，且文獻(xiàn)中有限的的信號歸屬也多屬推測性。筆者采用紅外吸收光譜（IR）、紫外-可見吸收（UV-VIS）光譜、核磁共振氫譜（1HNMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）、質(zhì)譜（EI-MS）等波譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究［6-12］，確定其紅外光譜、質(zhì)譜各峰的歸屬，并利用各種二維核磁共振技術(shù)歸屬了其碳譜和氫譜的信號，并結(jié)合紫外光譜的結(jié)果確證了金雀花堿的結(jié)構(gòu)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀：NEXus 870 型，美國熱電公司；

超導(dǎo)核磁共振譜儀：Bruker-AV500型，德國Bruker公司；

電子轟擊質(zhì)譜：GC／MS-QP2010 Plus型，日本島津公司；

元素分析儀：EL-III型，德國艾樂曼公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2100型，日本島津公司；

氘代氯仿（CDCl3）：NMR專用試劑；

甲醇：分析純；

乙腈：色譜純：

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；

金雀花堿樣品的元素測定值（括號內(nèi)為計(jì)算值）：C 69.41（69.45），H 7.40（7.42），N 14.63（14.72），換算為原子數(shù)比約為11∶14∶2，與金雀花堿樣品中C，H，N原子數(shù)比相當(dāng)。經(jīng)HPLC分析，結(jié)果表明純度大于99%，符合結(jié)構(gòu)鑒定要求，西安某藥業(yè)公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與測試條件

以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑空白：二甲基亞砜，掃描范圍：200～700 nm，記錄樣品紫外-可見吸收光譜；

采用KBr壓片法，測定范圍：4 000～400 cm-1，分辨率：4 cm-1，記錄樣品紅外光譜；

以CDCl3為溶劑，測試溫度為25℃，使用5 mm NMR 探頭，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)測定樣品NMR譜；

采用電轟擊模式（EI）離子源，離子源溫度200℃，掃描范圍為20～600 u，電子轟擊能量為70 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜

金雀花堿甲醇溶液的紫外光譜中，于λmax=306 nm處有最大吸收，是由芳雜環(huán)的雙鍵共軛的烯烴產(chǎn)生的最大吸收峰；λ=233 nm的吸收峰由—O=C基團(tuán)的n-π*的電子躍遷產(chǎn)生。說明本品的紫外吸收符合金雀花堿的紫外吸收特征。

2.2 紅外吸收光譜

采用溴化鉀壓片法測其紅外光譜，測定數(shù)據(jù)見表1。

表1 金雀花堿的IR測試結(jié)果解析表

金雀花堿紅外光譜圖中3 083 cm-1處的弱吸收峰為雙鍵的=CH伸縮振動，1 563，1 540 cm-1為C=C雙鍵的伸縮振動，746，735，820，791 cm-1為順式、三取代雙鍵的特征，這些都與預(yù)定結(jié)構(gòu)的環(huán)狀雙烯結(jié)構(gòu)應(yīng)有的吸收一致，1 649 cm-1處的強(qiáng)吸收為羰基伸縮振動，由于與雙鍵的共軛作用，吸收頻率較低，證明存在該結(jié)構(gòu)：

3 442，3 315，3 281 cm-1為 仲 胺 的—NH伸 縮振動特征，與預(yù)定結(jié)構(gòu)的—NH應(yīng)有的吸收一致，1 479，1 441，1 452，1 358，1 346，1 310 cm-1為—CH的彎曲振動，證明存在結(jié)構(gòu)：

上述結(jié)果表明：金雀花堿樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在羰基、雙鍵、叔氨基特征，樣品的紅外光譜吸收與預(yù)訂的化學(xué)結(jié)構(gòu)紅外吸收一致。

2.3 核磁共振波譜

使用氘代氯仿（CDCl3）溶解試樣，四甲基硅烷TMS 作內(nèi)標(biāo)（δ0），按1.2測定金雀花堿的1H NMR，13C NMR，DEPT135，DEPT90，1H-1H COSY，1H-1H NOESY，1H-13C HSQC及1H-13C HMBC譜，1H NMR，13C NMR譜圖分別見圖1、圖2，測定數(shù)據(jù)見表2。

圖1 金雀花堿樣品的1H NMR圖譜

圖2 金雀花堿樣品的13C NMR譜

對金雀花堿樣品的一維、二維NMR圖譜進(jìn)行分析，認(rèn)為金雀花堿符合預(yù)定化學(xué)結(jié)構(gòu)（見圖3）。

圖3 金雀花堿預(yù)定化學(xué)結(jié)構(gòu)及原子編號

樣品的1H NMR譜圖中，δ H 7.30峰是溶劑峰（未氘代完全的氯仿），δ H 2.17峰是殘留的微量丙酮溶劑峰，δ H 0.00峰為內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷（TMS）峰，其余信號為金雀花堿樣品的譜峰。氫譜中設(shè)定δ H 6.45的dd峰積分值為1，則圖譜總積分值為14，與預(yù)定分子結(jié)構(gòu)中的氫原子數(shù)目完全一致。δ H 5.50～δ H 7.50之間有三簇峰，分別為δ H 6.85（dd，J=6.9，1.1 Hz），δ H 6.45（dd，J=9.1，1.4 Hz），δ H 7.29（dd，J=9.1，6.9 Hz），從化學(xué)位移、耦合常數(shù)分析，應(yīng)為芳雜環(huán)氫，且3個氫緊鄰，可分別歸屬為H-8，H-7，H-9。δ H 1.45的寬矮峰含一個氫，歸屬為NH信號H-1。其余δ H 1.80～δ H 4.50之間有幾簇峰為環(huán)上的亞甲基，次甲基信號，H-4為手性亞甲基，兩個氫不等價，且受羰基與氮原子的影響，出現(xiàn)在較低場δ H 4.12（d，J=15.6 Hz）與δ H 3.90（dd，J=15.6 Hz，0.9 Hz），H-13則出現(xiàn)在較高場δ H 1.96，其余信號準(zhǔn)確歸屬需要二維譜。

樣品的13C NMR圖譜中，δ C 77.1處的三重峰為溶劑峰（氘代氯仿），δ C 0.00為內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷（TMS），剩余有11條譜線，與預(yù)定分子碳數(shù)目11一致。利用DEPT譜可判定11個碳中有2個季碳，6個仲碳，2個叔碳，與預(yù)定結(jié)構(gòu)一致。δ C 163.6的季碳為羰基C-6，δ C 163.6的季碳則為芳雜環(huán)季碳C-10，δ C 138.7，δ C 116.5，δ C 104.9的叔碳為芳雜環(huán)次甲基碳C-8，C-7，C-9。其余幾條碳為環(huán)烷上的亞甲基、次甲基信號。

1H-1H TOCSY譜可以提供各自旋體系的耦合信息，從1H-1H TOCSY譜中可以看出，有兩條自旋體系鏈，一組為芳雜環(huán)體系，另一組為環(huán)烷體系。1H-1H COSY可以提供1H-1H之間通過成鍵作用的相關(guān)信息，將自旋體系內(nèi)直接相鄰的1H信號關(guān)聯(lián)起來。從圖中可以看出，δ H 6.85（H-8）峰與δ H 6.45（H-7）、δ H 7.29（H-9）峰有耦合，形成芳雜環(huán)上相鄰三個氫一個自旋片斷。δ H 4.12（H-4a）、δ H 3.90（H-4b）峰只與δ H 2.32（m）峰有相關(guān)性，證實(shí)δ H 2.32（m）峰對應(yīng)于H-3。δ H 2.32（m，H-3）峰還與δ H 1.96（H-13）、δ H 3.09峰相關(guān)，故δ H 3.09峰對應(yīng)于H-2。

1H-13C HSQC譜可以將直接相連的氫與碳信號峰對應(yīng)于1H NMR和13C NMR信號，為確證其結(jié)構(gòu)提供了進(jìn)一步的證據(jù)。而δ C 163.6等季碳則無氫信號相對應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了季碳結(jié)構(gòu)。不對稱的CH2則由一個碳信號對應(yīng)于2個氫信號，如δ C 49.7為C-4，其對應(yīng)于2個氫信號δ H 4.12（H-4a）與δ H 3.90（H-4b）。其余直接相關(guān)信號都將一一對應(yīng)。由于氫信號的歸屬，使得相應(yīng)的碳信號明確。

采用1H-13C HMBC可確定季碳信號歸屬，并對整個體系信號作進(jìn)一步驗(yàn)證。從1H-13C HMBC譜圖中可以看出，δ C 163.6峰與H-8、H-7、H-4有相關(guān)性，證實(shí)該碳信號在結(jié)構(gòu)中位置為C-6。δ C 163.6峰則與H-8、H-9、H-4相關(guān)，同時還與H-12相關(guān)，證實(shí)該碳信號為C-10。C-2與C-12化學(xué)位移較為接近，從結(jié)構(gòu)可知，C-2與H-4為三鍵，可觀測到遠(yuǎn)程相關(guān)信號，C-12與H-4有5鍵，信號弱或沒有。通過HMBC圖中可以看到，只有δ C 53.0峰與H-4有相關(guān)信號，證實(shí)δ C 53.0峰對應(yīng)于C-2。從圖中還可以看到C-11與H-9、H-13、H-12的相關(guān)信號。其余相關(guān)點(diǎn)也能觀測到，與圖3結(jié)構(gòu)一致。

NOESY譜可以進(jìn)一步確認(rèn)化合物的空間結(jié)構(gòu)，同時也為相鄰片斷的位置判定提供依據(jù)。從NOESY譜中可以看出，δ H 3.08（H-2）峰與δ H 1.45（NH）峰存在空間耦合。δ H 7.29（H-9）峰與δ H 2.90（H-11）峰存在空間耦合。這些信息也與其預(yù)定結(jié)構(gòu)完全一致。

以上推斷證實(shí)樣品金雀花堿結(jié)構(gòu)與圖3結(jié)構(gòu)一致。將其NMR數(shù)據(jù)結(jié)果及解析一并列入表2中。

表2 樣品的NMR測試結(jié)果解析表

2.4 電子轟擊質(zhì)譜圖

取適量金雀花堿樣品放入進(jìn)樣桿，進(jìn)行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜圖見圖4。用所得試樣的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫搜索，從NIST08譜庫中檢索得到相似度為96%的金雀花堿譜圖，分子式為C11H14N2O，相對分子質(zhì)量為190.24。CAS編號為485-35-8，外文名為Cytisine。

圖4 金雀花堿樣品的EI質(zhì)譜圖

質(zhì)譜圖中最高質(zhì)荷比m／z 190為樣品的分子離子峰，說明其分子量為190，與預(yù)定結(jié)構(gòu)分子量一致；從最高質(zhì)荷比與高端質(zhì)荷比之差分析m／z 190-175=15；化合物質(zhì)譜裂解丟失合理，化合物的分子量為190 u。分子離子m／z 190豐度比較大表明化合物中含有多重共軛基團(tuán)，且具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使分子穩(wěn)定性較高。另外譜圖中m／z 146、m／z 44為化合物裂解生成的碎片峰。m／z 44是化合物羰基的α裂解或N的i裂解產(chǎn)生的碎片峰，其結(jié)構(gòu)式為：化合物中主要碎片峰m／z 190，m／z 160，m／z 146，m／z 44，m／z 134等符合化合物應(yīng)有的裂解機(jī)理。離子的具體裂解模式見圖6。

4 結(jié)論

圖6 金雀花堿樣品的質(zhì)譜裂解機(jī)理圖

研究運(yùn)用UV，IR，1D和2D NMR與MS 4 種波譜技術(shù)對金雀花堿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)解析，確定了IR 信號峰歸屬、NMR中主要碳（氫）信號的歸屬以及相互耦合關(guān)系、MS主要碎片離子的裂解途徑，這對金雀花堿及其同類藥物的結(jié)構(gòu)鑒定和質(zhì)量控制有重要價值。

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