生防菌株MT-06發(fā)酵條件及復配殺菌劑對小麥赤霉病的防效

毛雪琴，彭志榮，邱海萍，張 震，王艷麗，柴榮耀，姜 華，王教瑜，杜新法，孫國昌

(1.浙江省植物有害生物防控重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021;2.雜交水稻國家重點實驗室湖南雜交水稻研究中心，湖南長沙 410125)

小麥赤霉病是禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)引起的麥類常見的真菌性病害，發(fā)生廣泛，在我國流行很廣，特別是在雨量充足的長江中下游地區(qū)，造成麥類減產(chǎn)，品質(zhì)下降，經(jīng)濟損失嚴重［1-2］。1992-2001年，小麥赤霉病所造成的損失占總的麥類病害損失的35.7%［3］，此外還產(chǎn)生毒素，對人體健康及家禽家畜產(chǎn)生毒害［4］。

現(xiàn)階段對于赤霉病的防治主要依賴化學農(nóng)藥，長期使用造成農(nóng)藥殘留對人體的毒害，使植物產(chǎn)生抗藥性而防效降低，故開發(fā)生產(chǎn)選擇性強、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性的生物農(nóng)藥勢在必行。目前用于防治赤霉病的生防制劑主要是芽孢桿菌(Bacillus spp.)和假單胞桿菌(Pseudomonas spp．)［5-7］等細菌類產(chǎn)品。生防真菌能夠重寄生于病原菌并能夠長期定殖于防治對象而使效果持續(xù)時間延長［8］。現(xiàn)階段能夠防治赤霉病的真菌性生物制劑很少，對赤霉病有效的真菌性生防菌株也鮮見報道。

MT-06是本試驗室從草莓炭疽病標樣上分離獲得的黃藍狀菌 (Talaromyces flavus)，前期試驗結果表明，該菌株對大麥赤霉病菌等多種病原真菌具有較好的抑制作用［9］。本試驗分析了MT-06發(fā)酵液的最適培養(yǎng)條件及其對禾谷鐮刀菌菌絲和分生孢子的抑制作用，探討了抑菌活性物質(zhì)的萃取方法及粗提物的抑菌活性，并進行了MT-06與化學殺菌劑甲霜錳鋅混配防治小麥赤霉病的田間小區(qū)試驗，為生防菌MT-06的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及藥劑

黃藍狀菌MT-06及禾谷鐮刀菌FG-10均為本實驗室分離鑒定保存;化學殺菌劑甲霜錳鋅可濕性粉劑 (代森錳鋅64%，甲霜靈8%)由利民化工有限公司生產(chǎn);化學藥劑石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均由杭州雙林化工生產(chǎn)。

1.2 發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的抑制作用

1.2.1 發(fā)酵液的制備

將MT-06活化至PDA平板上，培養(yǎng)7 d后，打取5塊直徑為7 mm的菌餅，置于PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上，于28℃、150 r·min-1培養(yǎng)3 d。取孢子濃度1×106個·mL-1的發(fā)酵液，按5%接種量接種于裝有300 mL滅菌PDB的1 L三角瓶中，置于28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，12 d后，將培養(yǎng)液用濾紙濾去菌絲后，4℃下12 000 r·min-1離心30 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后4℃避光冷藏備用。

1.2.2 發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

平板抑制試驗。將滅菌后的PDA自然冷卻至60℃左右，在9 cm平板中加入18 mL PDA+2 mL發(fā)酵液，對照組為18 mL PDA+2 mL無菌水，待平板凝固后，用打孔器打取7 mm活化培養(yǎng)3 d后的禾谷鐮刀菌菌餅，置于平板中央，28℃避光培養(yǎng)4 d，十字交叉量取記錄菌落直徑，并取平均值。每處理重復3次，試驗重復2次。

抑菌率/%=(對照平均直徑-處理平均直徑)/(對照平均直徑-菌塊直徑) ×100。

凹玻片抑制試驗。挑取少量PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d后的禾谷鐮刀菌菌絲于分別裝有200 μL無菌水和MT-06發(fā)酵液的凹玻片中，28℃避光保濕培養(yǎng)48 h。目測菌絲生長情況，于顯微鏡100倍下觀察拍照。每處理重復3次，試驗重復2次。

1.2.3 發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響

平板抑制試驗。禾谷鐮刀菌孢子懸液通過0.45 μm孔徑濾膜除去菌絲，調(diào)整孢子濃度為1×106個·mL-1備用。將 100 μL 孢子液 +100 μL MT-06發(fā)酵液加入PDA平板上的牛津杯中，加入100 μL孢子液+100 μL無菌水為對照，28℃避光培養(yǎng)48 h，觀察孢子萌發(fā)情況。每處理重復3次，試驗重復2次。

凹玻片抑制試驗。在試驗組中加入100 μL禾谷鐮刀菌分生孢子液+100 μL MT-06發(fā)酵液，對照組中加入100 μL禾谷鐮刀菌分生孢子液 +100 μL無菌水，28℃避光培養(yǎng)48 h，觀察孢子萌發(fā)情況。每處理重復3次，試驗重復2次。

1.3 發(fā)酵液最佳培養(yǎng)時間測定

發(fā)酵液制備同1.2.1節(jié)。每24 h收集1次，連續(xù)收集30 d。以禾谷鐮刀菌為靶標菌，進行不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液抑菌活性測定，方法同1.2.2節(jié)。每處理重復3次，試驗重復2次。

1.4 發(fā)酵液萃取方法及活性物質(zhì)抑菌測定

將MT-06發(fā)酵液分別用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇等體積萃取3次，合并有機相，旋轉蒸干，得粗提物;按500 μg·mL-1的濃度用萃取劑溶解粗提物，以禾谷鐮刀菌為靶標，設置粗提物濃度分別為20，40，60，80，100 μg·mL-1，以 100 μg·mL-1百菌清為陽性對照，進行抑菌活性測定，方法同1.2.2節(jié)。

1.5 田間小區(qū)試驗

1.5.1 試驗地點及品種

在浙江省寧?？h越溪鄉(xiāng)灰場村進行，供試小麥品種為揚麥12號，播種方式為撒播。小麥赤霉病為田間自然發(fā)病，其他按常規(guī)栽培管理。

1.5.2 試驗設計

本試驗共設7個處理:①4 mg·mL-1甲霜錳鋅;②1×106個·mL-1MT-06孢子液+2 mg·mL-1甲霜錳鋅;③1×106個·mL-1MT-06孢子液;④MT-06發(fā)酵液;⑤稀釋5倍的 MT-06發(fā)酵液;⑥稀釋10倍的MT-06發(fā)酵液;⑦清水對照。每處理設3小區(qū)，每小區(qū)40 m2，隨機區(qū)組排列。其中MT-06孢子液的制備方法為MT-06孢子懸液通過0.45 μm孔徑濾膜除去菌絲，調(diào)整孢子濃度為1×106個·mL-1后備用。待小麥完全抽穗后按750 kg·hm-2噴霧量使用山東衛(wèi)士WS-16P噴霧器進行均勻噴灑。20 d后進行病情調(diào)查，調(diào)查方法、病情指數(shù)及防治效果計算參照GB/T 15796—1995。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)分析參見唐啟義等編著的第2版DPS軟件［10］，通過Duncan’s新復極差法進行比較。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

平板抑制試驗結果如圖1中A所示。培養(yǎng)4 d的結果顯示，稀釋10倍后的MT-06發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌絲生長抑制率為40.1%，表明MT-06發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌具有較強的抑制作用。凹玻片抑制試驗目測觀察如圖1中B所示。

置于MT-06發(fā)酵液和無菌水凹玻片中的禾谷鐮刀菌絲于28℃下保濕培養(yǎng)48 h后，對照組中禾谷鐮刀菌絲團增大變紅，試驗組基本無變化。鏡檢顯示，對照組產(chǎn)生了大量分生孢子 (圖1中C)，而試驗組則基本沒有產(chǎn)生分生孢子 (圖1中D)。表明發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌絲產(chǎn)孢具有強烈的抑制作用。

2.2 發(fā)酵液對鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響

平板抑制試驗表明，與等量MT-06發(fā)酵液混合后，禾谷鐮刀菌分生孢子不能萌發(fā)，抑制率達100%(圖2中B)。凹玻片抑制試驗鏡檢顯示，與等量MT-06發(fā)酵液混合的禾谷鐮刀菌分生孢子胞壁和隔膜變厚，兩頭變鈍，不能正常萌發(fā) (圖2中D)，與水混合的禾谷鐮刀菌分生孢子能正常萌發(fā)伸長產(chǎn)生菌絲 (圖2中E)。表明MT-06對禾谷鐮刀菌分生孢子的萌發(fā)具有強烈的抑制作用。

圖2 發(fā)酵液對鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響

2.3 發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)時間

通過30 d的取樣，將不同培養(yǎng)時間的MT-06發(fā)酵液稀釋10倍后，對禾谷鐮刀菌的抑菌活性測定結果表明，在PDB培養(yǎng)基中，28℃、150 r·min-1條件下，培養(yǎng)初期隨著時間的增加，MT-06發(fā)酵液抑菌活性越來越強，在第14天達到高峰，平板抑菌效果達到最高，為42.2%。隨著培養(yǎng)時間繼續(xù)增加，發(fā)酵液抑菌活性逐漸降低，第30天下降為18.7%。表明有效抑菌物質(zhì)在后期產(chǎn)量下降較快，并有一定降解，但仍具有部分抑菌活性，其中可能有部分抑菌活性物質(zhì)的化學性質(zhì)較穩(wěn)定。綜上可知，在既定條件下，MT-06的最佳發(fā)酵時間為14 d(圖3)。

2.4 萃取方法及活性物質(zhì)抑菌測定

圖3 發(fā)酵液在不同培養(yǎng)時間對鐮刀菌絲生長的抑制

通過不同萃取劑萃取后的抑菌測定發(fā)現(xiàn)，正丁醇和石油醚萃取物抑菌效果不明顯，而乙酸乙酯萃取物抑菌活性較強。稀釋10倍后抑菌率達到44.91%，由此確定萃取劑為乙酸乙酯 (圖4)。

圖4 乙酸乙酯萃取液對小麥赤霉病菌絲生長的影響

隨后通過乙酸乙酯大量萃取MT-06發(fā)酵液，進行活性粗提物抑菌測定 (表1)。

表1 乙酸乙酯粗提物對小麥赤霉病菌的抑制作用

以禾谷鐮刀菌為靶標，設置粗提物濃度分別為20，40，60，80，100 μg·mL-1，對照組為 100 μg·mL-1的百菌清。結果表明，隨著萃取物濃度提高，抑菌效果增強;當萃取物濃度為80 μg·mL-1時，抑菌活性與百菌清相當;當濃度提高到100 μg·mL-1時，抑菌效果顯著高于百菌清，達到71.80%。

2.5 田間小區(qū)試驗

田間試驗結果 (表2)表明，試驗各處理的病情指數(shù)均低于清水對照，其中防效最好的是處理②，及陽性對照處理①，防效分別達到72.62%和71.78%，高于其他4個處理，顯示極顯著差異。防效較好的還有處理④，為61.0%，高于處理③(31.49%)、⑤ (35.26%)和⑥ (23.17%)的防效，差異極顯著。綜上表明，發(fā)酵液在濃度較高時，對小麥赤霉病有較好防效，但隨著發(fā)酵液濃度降低，防效迅速下降。MT-06孢子液中加入2 mg·mL-1甲霜錳鋅后，防效極顯著地高于MT-06孢子液的處理，達到甚至超過了陽性對照4 mg·mL-1甲霜錳鋅的處理，但差異不顯著。表明菌藥混配可在不影響防效的情況下減少農(nóng)藥的使用量。

表2 MT-06及菌藥混配對小麥赤霉病防治效果

3 小結和討論

在確定MT-06對禾谷鐮刀菌具有抑制作用的基礎上，研究了MT-06的發(fā)酵條件，表明在PDB液體培養(yǎng)基中，5%接種量，28℃，150 r·min-1條件下，隨著培養(yǎng)時間的增加，發(fā)酵液的抑菌效果增強，到第14天時達到峰值。隨著培養(yǎng)時間延長，發(fā)酵液的抑菌效果逐步減弱，到第28天后，抑制率曲線趨于平緩。由此推測，MT-06的發(fā)酵產(chǎn)物中，具有抑菌活性的組分不止一種，既有易于降解的活性組分，也有性質(zhì)較穩(wěn)定的組分。本文初步探明了MT-06發(fā)酵液的萃取方法，獲得了具有抑菌活性的粗提物，有關活性物質(zhì)的成分分析及其作用機制還有待進一步研究。

由于單獨使用生防菌存在效果不穩(wěn)定和療效慢等缺點，采用化學農(nóng)藥與生防菌混配防治病害，具有一定的可行性［11］。化學農(nóng)藥可弱化病原菌，從而有利于生防菌對于病原菌的侵入與抑制［12］。本實驗室通過前期的室內(nèi)生測試驗，篩選出了甲霜錳鋅對小麥赤霉病菌具有強烈抑制作用，而對生防菌MT-06的影響相對較小。故開展了甲霜錳鋅與生防菌MT-06混配防治小麥赤霉病的田間小區(qū)試驗，結果顯示，生防菌孢子液中加入一定量的化學殺菌劑后，大幅增強了防治效果。1996年 Kantan［13］提出用農(nóng)藥弱化病原菌的方法提高生防效果。經(jīng)過化學農(nóng)藥對植物致病菌的弱化，生防菌定植于病原菌的能力增強，使得生防菌在與病原菌的對抗中占優(yōu)勢，并長期發(fā)揮作用。本文的研究結果與該報道一致，但其弱化的作用機制還有待研究。小區(qū)試驗還表明，MT-06與農(nóng)藥混配，可在保證相同防效的基礎上，降低農(nóng)藥的使用量，這為生防菌的開發(fā)利用提供了更多的思路。MT-06發(fā)酵液的田間使用對小麥赤霉病也有較好防效，但高效的發(fā)酵工藝及與化學殺菌劑的混配使用等問題還有待深入探討。

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