苯酚硫酸法與蒽酮硫酸法測定鐵皮石斛中多糖含量的比較

范傳潁，陶正明，，吳志剛

(1.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325035;2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005)

鐵皮石斛 (Dendrobium officinale)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳等功效，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱等多種病癥［1］。鐵皮石斛含有多糖、生物堿、萜類、揮發(fā)油、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分。現(xiàn)代藥理研究證明［2-4］，多糖具有增強免疫和抗腫瘤作用，鐵皮石斛多糖含量較高，而被認(rèn)為是其藥用的主要有效成分。

多糖含量測定的方法有很多。一類是利用多糖的還原性，如3，5-二硝基水楊酸鹽比色法和Somogyi-Nelson法;另一類是普遍使用的利用多糖在強酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)這一性質(zhì)進行測定，如苯酚-硫酸法和蒽酮硫酸法。本文在已有的研究基礎(chǔ)上［5］，對苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法測定多糖含量進行了比較，為確定合理的鐵皮石斛多糖含量測定方法提供依據(jù)。

1 材料與儀器試劑

鐵皮石斛由浙江雁蕩千山鐵皮石斛種植基地提供。

島津-2550型紫外可見分光光度計 (日本島津公司);Milli-Q A10型純水儀 (美國Millipore公司);Mettler Toledo AL204型電子天平 (瑞士);KQ500型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);DZF-6050型真空干燥箱 (上海恒一科學(xué)儀器有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市江南儀器廠)。

石油醚 (60～90℃)、乙醇、苯酚、濃硫酸、蒽酮均為分析純，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (分析純，用前105℃烘2 h)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵皮石斛多糖的提取與精制

稱取鐵皮石斛粉末25.0 g，置圓底燒瓶中，加入石油醚150 mL，回流提取1 h(去脂)，過濾，揮干溶媒。濾渣用80%乙醇150 mL回流提取1 h，過濾，揮干溶媒。濾渣用200，150，150 mL蒸餾水依次回流提取，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮至150 mL，與等體積 sevag試劑 (正丁醇∶氯仿為4∶1)萃取多次，取上清液，緩慢加入乙醇，使溶液含乙醇80%，在滴加過程中用磁力攪拌器攪拌，靜置過夜。過濾，沉淀用無水乙醇、丙酮清洗多次。沉淀置60℃真空干燥箱干燥，得鐵皮石斛精制多糖，封裝備用。

2.2 樣品制備及試劑配制

樣品制備。鐵皮石斛莖干燥后粉碎，取0.25 g粉末置圓底燒瓶中，加入石油醚50 mL，脫脂30 min，趁熱過濾，揮干溶媒。濾渣用80%乙醇回流提取1 h，趁熱過濾，濾渣用80%乙醇充分洗滌，再次揮干溶媒。殘渣用50 mL蒸餾水回流提1 h，過濾，再用35 mL蒸餾水回流提1 h，過濾，用少許熱水洗滌藥渣和燒瓶，合并濾液，冷卻后在100 mL容量瓶中定容，得樣品溶液。

對照品溶液的制備。精密稱取無水葡萄糖100 mg加蒸餾水定容至100 mL，搖勻，得1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液。

5%苯酚溶液的制備。精密稱取5 g苯酚，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻后，放置在棕色瓶中。

蒽酮硫酸溶液的制備。精密稱取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻，放置于棕色瓶中。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及換算因子

2.3.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置100 mL容量瓶中，各加蒸餾水至刻度。精密量取上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL于10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再精密加濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置90℃水浴中加熱15 min，取出，室溫放置冷卻，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在490 nm的波長處測定吸光度，得到回歸方程y=0.061 1x-0.024 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。表明葡萄糖濃度在2.5～15.0 μg·mL-1范圍與吸光度有良好的線性關(guān)系。

圖1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL 置 100 mL 容量瓶中，各加蒸餾水至刻度。精密量取上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL于10 mL具塞試管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0 mL，置水浴加熱15 min，取出，放入冷水中冷卻15 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，測定625 nm處吸光度。得到回歸方程y=0.010 9x+0.082 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。表明葡萄糖濃度在5～30 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖2 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 換算因子

精密稱取60℃干燥至恒重的鐵皮石斛多糖10 mg，配制成0.04 mg·mL-1溶液。取2.0 mL按苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，測定吸收度，從回歸方程中求得供試液中葡萄糖的質(zhì)量，按F=W/C計算換算因子。式中:W為實際多糖質(zhì)量，C為測得的多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量。計算結(jié)果為F=1.249。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度

取供試液按上述方法操作，連續(xù)測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)差0.46%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性

取供試液分別按照苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的操作，測定反應(yīng)結(jié)束后0，20，40，60，90，120 min時的吸光值。結(jié)果苯酚-硫酸法測得相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.30%，蒽酮-硫酸法測得相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.28%。

2.4.3 重現(xiàn)性

為考察方法的重現(xiàn)性，取同批次鐵皮石斛6份，按照2.2節(jié)方法制備，分別用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法測定其穩(wěn)定性，結(jié)果測得兩法的相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.88%和2.52%。

2.4.4 回收率

分別稱取已知含量鐵皮石斛粉末各0.25 g，分別精密加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液適量，按樣品制備和含量測定方法進行測定，計算加樣回收率 (表1)，考察方法的準(zhǔn)確度。

表1 加樣回收率

2.5 樣品的含量測定

9批鐵皮石斛 (60℃烘干后，粉碎備用)分別取0.25 g，按照2.2節(jié)方法制備樣品溶液。取1 mL樣品溶液置10 mL容量瓶中定至刻度，再從10 mL容量瓶中取1 mL至10 mL試管中，加水至2 mL，按照兩法各自標(biāo)準(zhǔn)曲線項下操作，由回歸方程計算出葡萄糖的質(zhì)量濃度 (表2)。

多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(CS·D·V·F)/W。

式中:CS為供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度;D為供試品溶液的稀釋倍數(shù);F為多糖的換算因數(shù);V為供試品溶液的體積;W為樣品質(zhì)量。

對表中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，方差齊性檢驗結(jié)果P＞0.1，無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認(rèn)為兩者的方差不等，因此可采用方差相等的配對t檢驗。檢驗結(jié)果t=2.019，查t表得P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認(rèn)為兩種方法測定鐵皮石斛多糖含量的結(jié)果不同，蒽酮-硫酸法測定結(jié)果偏高。

表2 樣品的含量測定

3 小結(jié)與討論

從方法學(xué)考察結(jié)果看，兩種測定方法均有精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好及操作簡單等特點，理論上均具有可行性。

苯酚-硫酸法測定時需注意兩點:一是苯酚易氧化，要用重蒸酚;二是反應(yīng)過程劇烈，應(yīng)避免不必要的傷害。蒽酮-硫酸法測定時，蒽酮硫酸需現(xiàn)用現(xiàn)配，相比苯酚硫酸法，反應(yīng)過程較溫和。

苯酚-硫酸法是常用測定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單、靈敏度高，試驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響。蒽酮-硫酸法幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用該法測出的多糖含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。因此，蒽酮-硫酸法測定結(jié)果偏高于苯酚-硫酸法。兩種方法相比，苯酚-硫酸法測定更為合理準(zhǔn)確，因此可作為鐵皮石斛多糖測定的首選方法。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版1部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:266.

［2］ 羅慧玲，蔡體育，陳巧倫，等.石斛多糖增強臍帶血和腫瘤病人外周血LAK細(xì)胞體外殺傷作用的研究［J］.癌癥，2000，19(12):1124-1126.

［3］ 張紅玉，戴關(guān)海，馬翠，等.鐵皮石斛多糖對S180肉瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響 ［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44(5):380.

［4］ 李欽，陳愛君，張信岳.鐵皮石斛顆粒增強免疫功能作用研究 ［J］.中藥藥理與臨床，2008，24(1):53.

［5］ 劉曉涵，陳永剛，林勵，等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較 ［J］.食品科技，2009，34(9):270-272.