2種抗生素對球等鞭金藻的毒理學研究

皋德祥，宋國梁，葛利云，鄧歡歡，張明華，3

(1.溫州醫(yī)學院水域科學與環(huán)境生態(tài)研究所，浙江 溫州 325035;2.環(huán)球環(huán)境保護科學設計研究院有限公司 ，浙江 紹興 312000;3.University of California Land，Air and Water Resources Department，Davis CA 95616)

球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)，亦稱金褐藻(golden brown algae)，屬于金藻門、普林藻綱、等鞭藻目、等鞭藻科、球等鞭金藻屬。球等鞭金藻無細胞壁，易消化.富含多糖、胡蘿素及高能量的脂類物質(zhì)，尤其是富含貝類生長發(fā)育所需的不飽和脂肪酸，DHA、EPA等，是一種在海洋中廣泛分布的單細胞藻類［1］。其特點是個體較小，繁殖較快，營養(yǎng)豐富，移動速度適中，沒有細胞壁，易被貝類的幼蟲捕捉、吞下和消化吸收，因而是海洋經(jīng)濟雙殼動物幼蟲良好的基礎餌料［2］。

抗生素類藥物主要用于治療人和動物的各種疾病，同時也長期用于動物飼養(yǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用來促進生長、繁殖和預防疾病，此類抗生素藥物大部分經(jīng)由人類和動物排泄物以原藥或者代謝產(chǎn)物的形式進入環(huán)境［3］。抗生素主要針對人類和動物體內(nèi)的病原性目標致病菌?？股丶捌浯x產(chǎn)物在環(huán)境中以低濃度存在，不僅會使環(huán)境中產(chǎn)生耐抗生素菌和抗性基因，還會對人體及環(huán)境中的其他非目標生物體產(chǎn)生潛在的生態(tài)毒理效應［4］。

球等鞭金藻在水產(chǎn)經(jīng)濟動物生產(chǎn)中有著重要的作用。作為一種具有DHA，EPA生產(chǎn)潛力的藻種，球等鞭金藻的研究越來越受到重視，由于球等鞭金藻個體小，生長繁殖快，營養(yǎng)豐富，且無細胞壁，因此是進行水生生態(tài)毒理學研究的理想測試體［5］。本文以球等鞭金藻為對象，選取了恩諾沙星(ENR)、鹽酸環(huán)丙沙星 (CIP)2種抗生素，研究了不同抗生素濃度對球等鞭金藻的生長量、葉綠素含量、過氧化氫酶 (CAT)活性等方面的抑制影響，目的在于為抗生素在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的合理安全使用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器材料

藻種為球等鞭金藻，取自浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖所，后經(jīng)溫州醫(yī)學院擴大培養(yǎng)。

抗生素為 ENT(純度≥98.0%，Amresco產(chǎn)品)和CIP(純度≥88.5%，Amresco產(chǎn)品)。

1.2 實驗方法

藻液的制備球等鞭金藻的培養(yǎng)選用F/2培養(yǎng)基，在BXZ智能型氣候箱內(nèi)進行，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)箱溫度 (25±1)℃，24 h光照，光強度4 000 lx，每天定時搖瓶4次。

F/2培養(yǎng)基1 L用量:75 g·L-1NaNO31 mL，5 g·L-1NaH2PO4·H2O 1 mL，30 g·L-1NaSiO3·9H2O 1 mL，3.15 g·L-1FeCl3·6H2O1mL，4.36 g·L-1Na2EDTA·2H2O 1 mL，0.75 g· L-1Na2HCO30.75 g，35 g·L-1海鹽35 g。配方中各試劑的用量加入到1 L錐形瓶中，再121℃高壓滅菌15 min待用。

抗生素濃度的選擇。先做預實驗，確定濃度范圍，使用96EC50值［6］包括在其中，在此濃度范圍內(nèi)取5個濃度值作為正式實驗的染毒劑量，同時還設對照組 (不添加抗生素)。

根據(jù)96EC50的濃度確定實驗組濃度梯度為:ENR分別為0，5，10，15，20，25 mg·L-1;CIP分別為0，2，5，10，30，50和70 mg·L-1;

將抗生素投入到球等鞭金藻生長到對數(shù)期的濃度一致的藻液中，每個濃度設兩組平行樣。測其初始吸光度。之后將藻液放在25℃人工氣候箱中，光強4 000 lx條件下培養(yǎng)，24 h光照，每天人工搖動4次，每天交換各瓶位置，使之均勻接受光照，試驗開始96 h后，取出測其吸光度，計算抑制率/%=100× (對照組-實驗組) ÷對照組。

1.3 分析方法

藻液濃度的測定。在680 nm波長下，以F/2培養(yǎng)基為參比測定原藻液及各工作藻液的吸光度值D680nm。以上測得的吸光度值 D680nm為橫坐標，球等鞭金藻個數(shù)為縱坐標繪制標準曲線，使用藻液時通過測定吸光度值D680nm來確定藻液濃度，計算公式為:藻液濃度=84.37D680nm-0.212，相關系數(shù)為R2=0.996，其中藻液的濃度以105為數(shù)量級。

葉綠素含量的測定。葉綠素的實驗室測量方法采用分光光度法［7］，采用丙酮熱提取法提取后利用分光光度計在某一特定波長下測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量［8-9］。葉綠素測定主要按照三色法公式，計算出葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素的含量。

CAT活性的測定。本文采用碘量滴定法［10］對球等鞭金藻的CAT活性進行測量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對球等鞭金藻生長量影響

2.1.1 ENR對球等鞭金藻96EC50的測定

將ENR分別投入到球等鞭金藻生長到對數(shù)期的濃度一致的藻液中，每個濃度設2個平行樣，測其初始吸光度;隨后將藻液放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，96 h后，取出分別測其吸光度，兩平行樣取平均值進行計算抑制率。圖1中將ENR濃度對數(shù)為橫坐標，計算得到的抑制率為縱坐標。圖中50%抑制率相對應的濃度即為ENR對球等鞭金藻的96EC50。

圖1 不同濃度ENR對球等鞭金藻抑制率的影響

圖1 中實驗數(shù)據(jù)表明，ENR濃度越高，其相對球等鞭金藻生長的抑制率也越高。當其濃度為25 mg·L-1時，抑制率達到65.80%。當抑制率為50%時，其對應的濃度約為8.913 mg·L-1。由圖1可見，在ENR毒性實驗中，其劑量、抑制效應關系表現(xiàn)良好，隨ENR濃度的增加，球等鞭金藻生長受到抑制愈加明顯，說明濃度越大，對藻液毒性越強，愈加抑制球等鞭金藻的生長。在0～10 mg·L-1濃度下有明顯的抑制效果。當 ENR濃度大于10 mg·L-1后，對球等鞭金藻的生長抑制幅度變小，抑制率趨于最大。

2.1.2 CIP對球等鞭金藻96EC50的測定

CIP對球等鞭金藻96EC50的實驗方法同ENT的方法。圖2中將CIP的濃度對數(shù)為橫坐標，計算得到球等鞭金藻的抑制率為縱坐標，圖中50%抑制率相對應的濃度即為CIP對球等鞭金藻的96EC50。

圖2 不同濃度CIP對球等鞭金藻抑制率的影響

圖2 表明，隨著CIP濃度的增加，其對球等鞭金藻的抑制效果也越明顯。本實驗設計的CIP濃度跨度大，當為70 mg·L-1時，其對球等鞭金藻的抑制率高達80.80%;當抑制率為50%時，其對應的CIP濃度為25.12 mg·L-1。由此可知，在 CIP毒性實驗中，其劑量—抑制效應關系表現(xiàn)明顯。隨CIP濃度的增加，球等鞭金藻的生長受到抑制愈加明顯，細胞密度逐漸降低。在0～70 mg·L-1的濃度梯度中，CIP對球等鞭金藻都有明顯的抑制效果，幅度較大。

2.2 抗生素對球等鞭金藻葉綠素含量影響

2.2.1 ENR對球等鞭金藻葉綠素含量的影響

在加入ENR 96 h后，對樣品的葉綠素含量也進行了測定，ENR濃度和葉綠素含量的關系如圖3所示。

圖3 不同濃度ENR對球等鞭金藻葉綠素含量的影響

圖3 中為不同濃度的ENR影響下葉綠素含量比較圖，本實驗分別測定了樣品的葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。ENR投加濃度范圍為0～25 mg·L-1，總?cè)~綠素濃度范圍在2.0 mg·L-1內(nèi)。由圖3可知，隨著ENR濃度的變化，球等鞭金藻葉綠素含量變化不大。在ENR濃度在15 mg·L-1時，球等鞭金藻葉綠素的含量甚至高于對照組的值。

2.2.2 CIP對球等鞭金藻葉綠素含量的影響

同樣在加入96 h后，CIP濃度和葉綠素含量的關系如圖4所示。

圖4 不同濃度CIP對球等鞭金藻葉綠素含量的影響

圖4 為不同濃度CIP影響下球等鞭金藻葉綠素含量的比較圖。本實驗分別測定了樣品的葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。CIP濃度范圍為0～70 mg·L-1，葉綠素濃度范圍在1.8 mg·L-1內(nèi)。CIP濃度在0～10 mg·L-1范圍內(nèi)，葉綠素含量有明顯的下降趨勢，其中葉綠素b下降的幅度比葉綠素a下降的幅度要明顯。CIP濃度在10～70 mg·L-1范圍內(nèi)，葉綠素含量整體平緩抗生素抑制球等鞭金藻的葉綠素趨于最大。而在整個濃度區(qū)間內(nèi)球等鞭金藻葉綠素b的含量變化一點都不明顯。

2.3 抗生素對球等鞭金藻CAT活性的影響

2.3.1 ENR對球等鞭金藻CAT活性影響

用碘量滴定法對加入了ENT的96 h后的球等鞭金藻樣品進行CAT測定。不同濃度ENT藻液培養(yǎng)96 h后，其濃度同球等鞭金藻CAT活性的關系如圖5所示。

圖5 不同濃度ENT對球等鞭金藻CAT活性的影響

圖5 中表明了隨著ENT的濃度的升高，球等鞭金藻的CAT活性呈遞減趨勢，ENT在0～25 mg·L-1范圍內(nèi)金藻的CAT濃度減少的幅度很小。

2.3.2 CIP對球等鞭金藻CAT活性的影響

用碘量滴定法對加入了CIP后96 h的球等鞭金藻樣品進行CAT活性測定。不同濃度CIP加入藻液培養(yǎng)96 h后，CIP濃度同球等鞭金藻CAT活性的關系如圖6所示。

圖6 中可以看出，CIP濃度在0～10 mg·L-1范圍時，球等鞭金藻CAT活性下降的比較明顯。在CIP濃度＞10 mg·L-1后，球等鞭金藻 CAT活性還是小于對照組的，但是減小的幅度隨著CIP的濃度升高而不明顯。

3 小結(jié)和討論

ENT和CIP對球等鞭金藻的96EC50的分別為8.913和25.12 mg·L-1，根據(jù)國家環(huán)保局的新化學物質(zhì)危害評估準則［11］中的生態(tài)毒理學危害性分級標準:EC50極毒 (3級)＜1.0 mg·L-1，高毒 (2級)1.0～10.0 mg·L-1，中毒 (1級)10.0～100.0 mg·L-1，低毒 (0級) ＞100 mg·L-1，確定 ENT和CIP對球等鞭金藻的危害等級分別為高毒和中毒，即分別為2級和1級。這表明水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)應該注意謹慎使用ENT和CIP等抗生素，認識到其對餌料球等鞭金藻的危害，以提高養(yǎng)殖產(chǎn)品的產(chǎn)量。

通過對投放2種抗生素的球等鞭金藻葉綠素測定結(jié)果表明，總體上來講2種抗生素對球等鞭金藻的葉綠素生長沒有明顯的抑制效果。ENT濃度在15 mg·L-1時球等鞭金藻的葉綠素含量甚至大于對照組葉綠素含量，這種現(xiàn)象可以用毒物的興奮效應來解釋，即在低濃度下某些有毒化合物可以在一定的程度上促進細胞的某些生理活動［12］。CIP在低濃度0～10 mg·L-1范圍內(nèi)對球等鞭金藻的葉綠素含量影響比較大，濃度越大抑制效果越明顯;而在＞10 mg·L-1后，隨著CIP濃度的升高，其對球等鞭金藻葉綠素含量的抑制效果基本達到了穩(wěn)定的趨勢，即達到了一個抑制的閾值。

通過對投放2種抗生素的球等鞭金藻的CAT活性的測定可以看出，總體上球等鞭金藻的CAT活性是隨著ENT和CIP濃度的升高有小幅度的減小。但是ENT濃度對球等鞭金藻的CAT活性影響不明顯。CIP在0～10 mg·L-1范圍內(nèi)對球等鞭金藻的CAT活性影響比較明顯，CIP濃度＞10 mg·L-1后，其濃度對球等鞭金藻的CAT活性抑制效果就基本上達到了穩(wěn)定的趨勢。

ENT對球等鞭金藻葉綠素與對CAT活性的影響效果一致，抑制效果均不明顯。而CIP對葉綠素和CAT活性的影響都表現(xiàn)為在0～10 mg·L-1濃度內(nèi)抑制效果較明顯，當濃度＞10 mg·L-1后，CIP濃度升高對兩者的抑制效果影響不大。這說明抗生素對葉綠素和CAT活性的作用機制在某種程度上有無相似性還有待進一步分析研究。

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