氟唑活化酯誘導玉米抗銹病的探討

張蕊蕊，胡偉群，朱衛(wèi)剛，陳 杰，李建高

(1.國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心浙江基地 浙江省化工研究院，浙江杭州 310023;2.南通泰禾化工有限公司，江蘇 南通 226000)

玉米起源于美洲，作為糧食種植于中美洲、南北美洲已經(jīng)有上千年的歷史。玉米銹病在世界種植區(qū)內(nèi)均有發(fā)生［1］，主要包括普通玉米銹病 (Puccinia sorghi Schw)，南方玉米銹病 (Puccinia．polysora Underw)和熱帶玉米銹病 (Physopella zeae(Mains)Cumm.and Ramochar)3種。其中，普通玉米銹病主要在中國黃淮海以及新疆玉米種植區(qū)發(fā)生［2-3］，南方玉米銹病主要發(fā)生在中國南方地區(qū)［4］，熱帶玉米銹病在中國海南以及臺灣地區(qū)時有發(fā)生［5］。

目前防治玉米銹病的方法主要通過種植抗病品種及適當?shù)幕瘜W防治。生產(chǎn)上常使用三唑類和有機硫類殺菌劑對之進行防治。植物病害防治的另一種重要途徑是利用生物或者非生物的植物誘導抗病激活劑，通過激活植物體自身的免疫系統(tǒng)來抵抗植物病害的侵襲。植物抗病激活劑自身沒有殺菌活性，但可誘導植物自身產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。植物抗病激活劑具有廣譜性且不誘導植物產(chǎn)生抗藥性。迄今為止，已經(jīng)商品化的植物抗病激活劑有活化酯(BTH)、烯丙苯噻唑、有效霉素A和tiadinil等［6］。

氟唑活化酯是由華東理工大學創(chuàng)制開發(fā)的新型化合物，屬于植物抗病激活類誘導劑［7］。此類活化酯衍生物可用于誘導植物次級代謝產(chǎn)物紫杉類化合物;同時，研究發(fā)現(xiàn)該類化合物可誘導植物產(chǎn)生抗性反應，包括促進活性氧迸發(fā)以及激活苯丙氨酸解氨酶 (PAL)等［8］。通過研究施藥次數(shù)、施藥濃度及接種天數(shù)對氟唑活化酯防治玉米銹病的影響，并對其誘導的生理機制進行了初步探索，以期為氟唑活化酯的合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試藥劑為5%氟唑活化酯乳油，上海泰禾化工有限公司提供;供試菌種為普通玉米銹病Puccinia sorghi Schw，浙化院生測安評中心活體繼代培養(yǎng);供試植物為玉米品種農(nóng)大108。

1.2 方法

1.2.1 不同處理對誘導玉米銹病生物活性的影響

將供試藥劑配制成 6.25，12.50，25.00，50.00 mg·L-1濃度的藥液備用，以清水處理為空白對照，設(shè)2次用藥與1次用藥2個處理，重復3次。

2次用藥是在植株2葉1心期施藥1次，采用葉面噴霧施藥，將供試藥劑均勻噴施到苗齡一致的植株葉面，以噴濕不滴水為宜。每隔5 d噴霧1次，共施藥2次。分別于第2次藥后3，5，7，9 d噴霧接種孢子濃度為10萬個·mL-1左右的玉米銹病孢子懸浮液。接種后的試材自然風干，然后移至人工氣候室 (25℃，相對濕度70%)，8 d后視空白對照發(fā)病情況進行分級調(diào)查，按病指計算防效。

1次用藥時只施1次藥，時間與2次用藥時的第1次施藥同時進行，分別于施藥后3，5，7，9 d接種玉米銹病。接種后的試材自然風干，然后移至人工氣候室，8 d后視空白對照發(fā)病情況進行分級調(diào)查，按病指計算防效。

參照李復寧［9］對小麥條銹病嚴重度的研究，將玉米銹病分為以下6級:0級，無病癥;1級，葉片整個發(fā)病面積5%及以下;2級，葉片整個發(fā)病面積達10% ～20%;3級，葉片整個發(fā)病面積達30%～40%;4級，葉片整個發(fā)病面積達50%～60%及以下;5級，葉片整個發(fā)病面積達80%～100%，葉片枯死。

1.2.2 氟唑活化酯誘導植株體內(nèi)POD和PAL活性

用50.00 mg·L-1氟唑活化酯處理2葉1心期玉米植株，于噴藥后3，5，7，9，14 d測定植株體內(nèi)POD、PAL活性，以未噴施的植株為空白對照，每處理重復3次。

1.3 酶活測定

PAL的提取及測定參照薛應龍［10］的方法稍加改進:稱取4 g葉片，冰浴后加10 mL含有5 mmol·L-1β-巰基乙醇的pH值 8.8的硼酸鹽緩沖液、0.5 g聚乙烯吡咯烷酮及少量石英砂研磨勻漿。在4℃條件下，10 000 g離心15 min，上清液用于PAL的測定。酶液反應體系為:0.1 mL PAL提取液，3.9 mL 0.05 mol·L-1pH值8.8的硼酸緩沖液，1 mL 0.02 mol·L-1苯丙氨酸，40℃保溫1 h，而后用0.2 mL的6 mol·L-1HCl終止反應。測光密度值D290，以未經(jīng)誘導的植株為對照。

POD的提取及測定參照李合生［11］的方法稍加改進:稱取 4 g葉片，冰浴后加 15mL 0.05 mol·L-1pH值8.8的磷酸緩沖液和少量石英砂研磨勻漿。在4℃條件下，10 000 g離心15 min，上清液用于POD的測定。用愈創(chuàng)木酚和H2O2比色法測定，依次加以下反應液:2.91 mL的0.05 mmol·L-1磷酸緩沖液 (pH 值8.8)，1 mL的0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚，0.1 mL上述酶液，1 mL的 2%H2O2，34℃保溫3 min，迅速稀釋1倍，測定測光密度D470，每隔1 min記錄1次，共記錄5次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

百分比數(shù)據(jù)先進行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，應用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行三因素方差分析，采用LSD法進行多重比較［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對植株病情指數(shù)和防效的影響

通過表1可以看出，隨著藥劑濃度的增加，病情指數(shù)有降低的趨勢。在1～2次用藥情況下，藥后5 d接種的病情指數(shù)要低于藥后3 d接種的病情指數(shù)。藥后7 d接種的病情指數(shù)稍高于藥后5 d接種的病情指數(shù)。1次藥后3 d接種的病情指數(shù)略微高于2次藥后3 d接種的病情指數(shù)，前者對玉米銹病的防效略微低于2次用藥后的藥劑防效。上述結(jié)果可知，隨著藥劑濃度增加，病情指數(shù)顯著降低，藥劑防效顯著升高;隨著用藥次數(shù)增加，防效有所增加，但是1次與2次施藥處理間沒有顯著性差異。

通過三因素互作方差分析表2可以看出，藥劑濃度及接種天數(shù)對病情指數(shù)及藥劑防效的影響均達到了顯著水平。施藥次數(shù)及接種天數(shù)的互作對病情指數(shù)及藥劑防效的影響也達到了顯著水平。施藥次數(shù)對病情指數(shù)及藥劑防效的影響不顯著。

2.2 氟唑活化酯對植株體內(nèi)酶活性的誘導

由圖1可知，當施用氟唑活化酯5 d之后，植株體內(nèi)的POD活性顯著升高，與未施用的活性差異顯著。施用7 d之后，植株體內(nèi)POD活性有了極顯著升高。施用9 d之后，植株體內(nèi)POD活性下降，且與未施用的植株之間沒有顯著性差異。施用14 d之后，植株體內(nèi)POD活性下降，且與未經(jīng)施用的植株之間沒有顯著性的差異。

由圖2可知，與未經(jīng)施用氟唑活化酯的植株相比，施用之后5～14 d的植株體內(nèi)的PAL活性都有了顯著性升高。

表2 三因素互作方差分析

圖1 氟唑活化酯處理對植株體內(nèi)POD活性的影響

施用5 d之后，植株體內(nèi)的PAL活性有了極顯著的升高;施用7 d之后植株體內(nèi)的PAL活性有所下降，但與未施用的植株的差異達到極顯著水平;施用9 d之后，植株體內(nèi)PAL活性下降，但與未施用的植株之間差異極顯著。14 d之后PAL酶活有略微的上升，與對照之間差異顯著。

圖2 氟唑活化酯處理后植株體內(nèi)PAL活性變化

3 小結(jié)與討論

Sharma等［13］研究表明，植株病情指數(shù)會隨著施用BTH次數(shù)的升高而降低。本研究表明，施藥次數(shù)對植株病情指數(shù)的影響不明顯，可能是由于試驗作物不一。前者試驗中的作物為雙子葉植物豆類，本試驗中供試作物為單子葉植物玉米。與前者進行的田間試驗不同，本試驗在可控溫控濕的人工氣候室中進行。田間與室內(nèi)試驗條件的差異可能導致了最終試驗結(jié)果的差異。

本研究表明，施藥濃度對病情指數(shù)的影響達到了顯著水平。隨著施藥濃度的升高，植株病情降低。但在黃瓜上的預試驗表明，在100 mg·L-1條件下，氟唑活化酯對黃瓜植株產(chǎn)生輕微要害，當濃度達到200 mg·L-1時，對黃瓜植株產(chǎn)生葉片焦枯、皺縮等嚴重藥害癥狀。因此在氟唑活化酯施用時，選擇合適的濃度是必要的。

接種天數(shù)對病情指數(shù)的影響也達到了顯著水平。研究表明，施用抗病激活劑類藥劑之后，單子葉植物可以獲得終身獲得抗性［14-15］。李喜娥等［16］研究發(fā)現(xiàn)，BTH類抗病激活劑能夠影響植株葉片的光合作用特性，能夠提高植株葉片的凈光合速率、葉綠素含量等并能夠降低葉片受侵染后產(chǎn)生的光合作用下降等癥狀。因此在植株發(fā)病前較早施用氟唑活化酯，使植株可能較早獲得終身抗性，配合抗病品種的種植，可增強植株抵抗病蟲害的能力。

李玉紅等［17］研究表明，BTH類抗病激活劑能夠顯著誘導植株發(fā)病前期引起植株體內(nèi)H2O2的積累，且能夠增加植株發(fā)病后期消除過量H2O2的能力。Xu等［8］研究發(fā)現(xiàn)，BTH衍生物可以誘導植株產(chǎn)生抗病反應，能夠促進植物體內(nèi)的活性氧的迸發(fā)以及激活苯丙氨酸解氨酶。本研究表明，植株施用氟唑活化酯3～5 d之后，其體內(nèi)的 POD、PAL活性有了極大的提高，與對照相比達到了顯著水平。一般來說，2次施藥之后植株體內(nèi)2種酶的活性會再次升高。氟唑活化酯可以誘導植物體內(nèi) POD、PAL活性的升高，是氟唑活化酯的誘導機制之一。

Sharma等［13］研究結(jié)果還表明，增加施藥次數(shù)能夠顯著增加作物產(chǎn)量;更有研究表明，施用BTH類抗病激活劑能夠提高果實品質(zhì)和產(chǎn)量［18］。本試驗中由于條件限制并未進行收獲后的產(chǎn)量評價。建議對于氟唑活化酯這種新化合物繼續(xù)進行田試研究。

綜合考慮不同施藥次數(shù)、藥劑濃度及接種天數(shù)對玉米銹病病情指數(shù)及藥劑防效的影響及施藥之后植株體內(nèi)相關(guān)酶活的變化，氟唑活化酯在藥后5 d出現(xiàn)誘導抗性高峰，且隨著用藥次數(shù)增加，防效有所升高。結(jié)合田間農(nóng)民用藥習慣，建議氟唑活化酯施藥方式為施藥2次，間隔5 d。在病害發(fā)生前期施用，結(jié)合抗病品種的種植，培育無病壯苗，對病害進行預防性控制是關(guān)鍵。

［1］ Nattrass R M.Occurrence of Puccinia polysora Underw.in East Africa ［J］.Nature，1953，171:527.

［2］ 馬德成，葉梅，魏建華，等.新疆玉米銹病發(fā)生初報 ［J］.新疆農(nóng)業(yè)科技，2008(2):42.

［3］ 馬清禮.玉米銹病的發(fā)生與防治 ［J］.安徽農(nóng)學通報，2006，12(10):147.

［4］ 王超，陳月娣，趙小燕.嘧菌酯等藥劑對玉米銹病后期病害的防治試驗 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2011(6):1353-1354.

［5］ Hou H H，Tseng J M，Sun M H.Occurrence of corn rusts［Puccinia sorghi，Puccinia polysora］ in Taiwan ［J］.Plant Disease Reporter，1978，62:183-186.

［6］ 張一賓.植物抗性誘導機理、抗病激活劑及其研發(fā)方向［J］.世界農(nóng)藥，2008，30(5):1-5.

［7］ ZhuW P，Zhao Z J，Xu Y F.Derivatives of benzothiadiazole-7-carboxylates:synthesis and biological activity ［J］.Monatshefte für Chemie，2008，139:1067-1071.

［8］ Xu Y F，Zhao Z J，Qian X H，et al.Novel，Unnatural benzo-1，2，3-thiadiazole-7-carboxylate elicitors of taxoid biosynthesis［J］.Agricultural and Food Chemistry，2006，54:8793-8798.

［9］ 李復寧.小麥條銹病嚴重度分級標準的研究簡報 ［J］.植物保護，1991，17(2):30.

［10］ 薛應龍.植物生理學實驗手冊 ［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1985:191-192.

［11］ 李合生，孫群，趙世杰，等.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000:164-167.

［12］ 唐啟義，馮明光.DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) ［M］.北京:科學出版社，2010:102-105.

［13］ Sharma K D，Sharma V，Singh R，et al.Control of chickpea blight disease caused by Didymella rabiei by mixing resisitence inducer and contact fugucide［J］.Crop Protection，2011，30:1519-1522.

［14］ Dann E K，Deverall B J.Effectiveness of systemic resistance in bean against foliar and soilborne pathogens as induced by biological and chemical means ［J］.Plant Pathology，1995，44:458-466.

［15］ Dann E，Diers B，Byrum J，et al.Effect of treating soybean with 2，6-dichloroisonicotinic acid(INA)and benzothiadiazole(BTH)on seed yields and the level of disease caused by Sclerotinia sclerotiorum in field and greenhouse studies［J］.European Journal of Plant Pathology，1998，104:271-278.

［16］ 李玉紅，程智慧，陳鵬，等.苯丙噻二唑 (BTH)誘導黃瓜幼苗對霜霉病抗性的研究 ［J］.園藝學報，2006，33(2):278-282.

［17］ 李喜娥，陳年來，王春林，等.BTH和SA處理及白粉病原菌接種對甜瓜葉片光合特性的影響 ［J］.西北植物學報，2007，27(8):1643-1649.

［18］ 劉敏.南山甜桃采前 BTH處理對采后儲藏品質(zhì)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(34):19570-19571.