原油微生物群落構(gòu)成及降解菌降解特性的研究

王中華 梁靜兒 楊建強 周君 李成華 李太武，3

（1. 寧波大學海洋學院，寧波 315211；2.國家海洋局北海分局，青島 266033；3.寧波城市職業(yè)技術(shù)學院，寧波 315100）

溢油事故發(fā)生后，原油中某些相對分子質(zhì)量小，沸點低的烴類組分，數(shù)日后可揮發(fā)進入大氣，占絕大多數(shù)的沸點高的烴類組分的化合物隨海水運動而擴散轉(zhuǎn)移。自然條件下，這些物質(zhì)一部分由懸浮顆粒吸附沉降于海底或者被浮游生物所攝取、代謝和分解，而大部分則被微生物降解。目前，處理原油污染主要有物理法，如用抽吸機吸油，用水柵和撇沫器刮油、燃燒除油以及用油纜阻擋石油擴散等；化學法，如噴灑化學藥劑使石油加速分解等。然而，當溢油事故發(fā)生于近海，漂浮的原油會附著于沙灘，近海巖礁等，甚至會滲透到表面以下幾米的地方，普通的物理化學法難以從根本解決問題。而生物法以其處理成本低、效果好等優(yōu)點被認為是有機污染物修復中最有效和可靠的方法［1］。原油在開采和運輸中的附著微生物，適應惡劣生存條件，能夠以原油為碳源進行新陳代謝，這也是原油降解微生物的重要來源。

國內(nèi)外學者已從海洋、油污染土壤當中獲得了多株高效高效原油降解微生物［2-5］，不同降解微生物對原油組分的降解能力不同。16S rDNA 技術(shù)的研究，更好地揭示了原油當中微生物群結(jié)構(gòu)及其遺傳的多樣性，原油中微生物的組成，并能夠為原油降解菌的篩選提供菌種來源。

烴類物質(zhì)是石油的主要組分，約占石油總量的95%以上，包括正構(gòu)烷烴、異構(gòu)烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴等［6］。對這些組分的研究能夠在一定程度上揭示原油的降解過程和特性。本研究采用直接向原油中添加營養(yǎng)物質(zhì)的方法，在營養(yǎng)物的刺激下活化原油中原有的微生物，對原油降解菌進行分離純化，通過紅外光譜以及氣相色譜研究原油的降解過程以及降解菌的降解特性，通過紫外吸收法對其降解率進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用原油取自于寧波港原油運輸船金色大地油輪，采集后放入無菌瓶中。海水培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，陳海水1 L，自然pH。原油培養(yǎng)基：海水培養(yǎng)基加0.3%原油，自然pH。油平板：海水培養(yǎng)基加入2.0%的瓊脂和0.3%的原油，自然pH。降解培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，MgSO40.2 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO4·H2O 1.0 g，原油1.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 原油的微生物降解 海水培養(yǎng)基滅菌后加入0.3%原油，37℃、170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，得到原油乳化物和細菌的混合體系后，立即進行紅外光譜掃描和氣相色譜分析。

降解菌體系群轉(zhuǎn)接3次，使其中能夠降解石油的微生物得到富集并成為優(yōu)勢菌。將所獲得的石油降解菌體系按不同的濃度梯度涂布于含有0.3%的石油的固體平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取生長在油斑上的菌落，劃線法進行純化。純化后的單菌落接種到原油培養(yǎng)基，原油降解后立即進行紅外光譜掃描和氣相色譜分析。

1.2.2 紅外光譜法檢測原油的降解 以環(huán)己烷為萃取劑，近紅外譜圖測定范圍4 000-1-10 000 cm-1，中紅外譜圖測定范圍400-1-4 000 cm-1，掃描次數(shù)40次，分辨率8 cm-1，掃描扣除H2O和CO2的干擾，每個樣品譜圖取5次測量的平均值。調(diào)用OPUS 軟件（Bruker公司，Germany）進行譜圖處理。

1.2.3 氣相色譜法檢測原油的降解

1.2.3.1 氣相色譜條件的確定 GC-2010氣相色譜儀（島津公司，日本），配用FID 檢測器，HP-5 石英毛細管柱（30 m ×0. 32 mm ×0. 25 μm）。根據(jù)有關(guān)資料并結(jié)合本儀器的具體情況，經(jīng)反復比較試驗，確定以下試驗條件所得結(jié)果較理想：進樣口溫度：280℃，分流比：1/ 1.5，檢測器溫度：300℃，載氣：高純N2，氫氣壓力：100 kP，空氣壓力：156 kP，柱流速：2.75 mL/min。升溫程序：初溫60℃（保持1 min），從60℃升至100℃（升溫速度20℃/ min，保持2 min），從100℃升至280℃（升溫速度8℃/ min，保持12 min）。采用GC-2010自動進樣器，進樣量為1 μL，無分流進樣。

1.2.3.2 烷烴標準曲線的確定 準確稱取烷烴標準物，用石油醚定容，配成終濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL的烷烴標準液，進行氣相色譜分析，確定烷烴標準物保留時間出峰位置，并繪制濃度與峰面積的標準曲線。

1.2.4 原油降解率的測定 將原油溶于石油醚繪制原油標準曲線，采用紫外分光光度法結(jié)合公式通過殘油濃度［10］來計算原油降解率。計算公式：

降解率（%）=（初始原油濃度-殘余原油濃度）/（初始原油度）×100%

1.2.5 降解菌體系微生物多樣性分析 提取細菌總 DNA具體步驟參考文獻［7］。以所提 DNA 為模板，采用細菌 16S rDNA擴增通用引物16s F：（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16s R：（5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'）為引物，進行PCR擴增。反應體系：10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，模板DNA 稀釋100倍1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L引物各1 μL，1.0 U/反應Taq DNAase，ddH2O補 足 至25 μL。PCR擴 增 條 件 為：95℃預 變 性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用試劑盒回收純化后與 PMD18- Tvecter載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建構(gòu)建 16S rDNA文庫。

1.2.6 降解菌的鑒定 （1）降解菌的分子生物學鑒定：將原油降解混合體系梯度稀釋后涂布于油平板，挑取生長在油上的單菌落，多次劃線進行純化后通過16S rDNA鑒定，PCR方法同1.2.5。結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中序列進行比較分析。（2）細菌自動鑒定系統(tǒng)鑒定：根據(jù)皂化作用提取降解率最高的2株細菌細胞脂肪酸甲酯，利用細菌自動鑒定系統(tǒng)軟件，將細胞脂肪酸甲酯的峰形圖與各微生物的模式圖進行比較分析以鑒定細菌的分類地位。

2 結(jié)果

2.1 原油的降解分析

對原油富集培養(yǎng)產(chǎn)物進行觀察后發(fā)現(xiàn)，細菌大量生長使培養(yǎng)基渾濁，第 7天原油產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，部分原油乳化后進入培養(yǎng)基。到第 21天，原油幾乎全部乳化成絮狀物，此時培養(yǎng)基由澄清淡、黃色、不透明變?yōu)樯詈稚瑴啙?、不透明（圖1）。

對原油進行全波長掃描分析后，可見被測石油在波長225 nm 處有明顯的吸收，故試驗采用225 nm 作為測定波長。根據(jù)公式利用UV法測得這些細菌對原油的降解率為58%。

原油中紅外光光譜掃描結(jié)果，見圖2，中紅外原油特征譜峰主要有3簇，第一簇峰3 000 cm-1譜帶歸屬為芳烴化合物環(huán)的C-H鍵，降解后消失，2855 cm-1譜帶為烷烴甲基伸縮振動，降解后振動減弱；第2簇峰，1 377 cm-1處直鏈烷烴甲基和亞甲特征吸收峰，1 470 cm-1處烷烴亞碳基變形振動，降解后顯著減小，進一步證實了烷烴C-H的氧化分解；第3簇峰800 cm-1、870 cm-1的譜帶為芳香族C-H鍵，降解后幾乎消失，723 cm-1為鏈烯烴以及碳數(shù)≥7的直鏈烷烴亞甲基，細菌作用后也幾乎消失。

表1 GC法標準曲線測定結(jié)果

烷烴標準物的氣相色譜圖如圖3所示，各個組分分離較好，nC10-nC25清晰譜峰，通過保留時間可知各沸點烷烴的出峰位置。5個不同濃度的烷烴標準物和氣相色譜峰面積得到標準曲線（表1，圖4）。樣品和峰面積存在一定聯(lián)系，隨著樣品濃度增加，峰面積也相應變大，呈線性關(guān)系。

由原油降解的氣相色譜圖（圖5）可知，原油經(jīng)W-菌群降解處理后氣相色譜圖中各個組分的色譜峰幾乎消失，只有C16-C19還有較弱吸收峰，其余大部分烷烴都已降解。菌群降解原油7 d后，保留時間在8 min之前的低沸點飽和烷烴幾乎全部降解，說明從原油中培養(yǎng)得到的微生物群落有很強的降解能力。

2.2 降解菌體系的微生物多樣性組成

原油中培養(yǎng)出的細菌種類繁多，通過菌的掃描電鏡照片（圖6），可見細菌呈現(xiàn)不同形狀，有短桿狀，長桿狀，八疊體等，這些細菌構(gòu)成一個微小生態(tài)群落，使得原油的外觀狀態(tài)發(fā)生改變，說明其中一定含有高效降解菌。

為進一步研究降解菌體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，構(gòu)建了降解菌體系的克隆文庫，隨機挑取陽性克隆子進行測序分析，結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對和歸類分析，結(jié)果（表2）顯示序列相似性最高為99%，最低為89%，其中有94% 分別屬于Proteobacteria類群（α-Proteobacteria和β-Proteobacteria變形菌門）和Firmicutes類群，而 6%的克隆子與已知類群相似性較低，在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找到與其相似的已知細菌序列，屬于未知類群，與未獲培養(yǎng)細菌marine bacterium（EU741662）和Uncultured bacterium（EU741663）的同源性分別為90%和89%。其中，Proteobacteria類群是文庫中第一大類群，而蒼白桿菌屬又是其中數(shù)量最多的一類；在Firmicutes類群中，所占百分比最多的是芽孢桿菌屬細菌。根據(jù)測得的16S rDNA序列構(gòu)建降解菌體系系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。

2.3 降解菌的鑒定

對所分離的降解菌中降解率超過50%的5號菌株命名為Wle-5，經(jīng)多次分離純化后進行分子鑒定，結(jié)果顯示，Wle-5菌株的16S rRNA序列與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的16S rRNA序列相似性為100%；測序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為EU789571。同時對所篩選得的細菌通過微生物自動鑒定系統(tǒng)進行分析，鑒定結(jié)果表明Wle-5為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）與分子生物學鑒定結(jié)果相吻合，可以確定所分離的株菌為短小芽孢桿菌。

表2 原油WLE內(nèi)源菌體系16s rDNA克隆庫結(jié)果

2.4 降解菌降解能力的測定

2.4.1 紅外光譜吸收的變化 原油在近紅外譜區(qū)有特征吸收峰，且不同種類的原油吸收峰形不同，而近紅外光譜可檢測到原油組分的細微變化。試驗所用原油在4 000 cm-1-4 500 cm-1和5 600 cm-1-6 000 cm-1的兩簇普峰有強烈吸收，其中4 000-1-4 500 cm-1譜區(qū)由2個主峰和2個小峰組成，特征峰最明顯，這是原油的“指紋區(qū)”。高效降解菌Wle-5對原油的降解作用通過近紅外光譜掃描所得結(jié)果，見圖8。隨著原油降解時間變長，原油特征峰信號都逐漸減弱。

降解菌Wle-5對原油的降解20 d后通過中紅外光譜掃描所得結(jié)果，見圖9。光譜圖中第三簇峰在細菌作用20 d后都消失，說明原油的烯烴末端甲基和亞甲基被氧化；第二簇峰信號減弱，但未完全消失，原油的C=O鍵依舊存在；第一簇峰經(jīng)Wle-5菌株降解后顯示，肩峰（2 960 cm-1）消失，主峰不明顯（2 920 cm-1）。

2.4.2 烷烴含量的變化 由原油降解的氣相色譜分析可知，經(jīng)Wle-5降解處理后氣相色譜圖中各個組分的色譜峰統(tǒng)一呈整體下降趨勢，尤其是低沸點飽和烴和部分芳香烴降解效果顯著，表明其對不同結(jié)構(gòu)的烴類化合物均具有較強的降解能力。圖10-c可見，經(jīng)過21 d的降解處理后，原油的殘余量已經(jīng)很少，適當延長降解時間后，原油中烴類物質(zhì)的降解率增加。

表3 兩株菌作用前后原油飽和烴氣相色譜分析結(jié)果

Wle-5菌株降解原油21 d后，保留時間在8 min之前的低沸點飽和烷烴幾乎全部降解，保留時間在20 min以后的高沸點飽和烷烴和芳香烴含量減少，部分被降解。氣相色譜分析數(shù)據(jù)顯示（表3），原油經(jīng)菌種作用以后，飽和烴碳鏈分布發(fā)生了明顯的變化，高碳鏈飽和烴的相對含量降低，低碳鏈飽和烴的相對含量則相應增加。Wle-5作用原油后，不同程度地引起Pr/nC27與Ph/nC28值分別增加了9.5%和23.1%，進一步從數(shù)據(jù)是上表明Wle-5對原油中高碳鏈的飽和烷烴都具有生物降解作用。

3 討論

原油在儲藏和運輸過程中所含的細菌可能與原油具有附生關(guān)系，有些細菌在原油惡劣環(huán)境中突變，受外界營養(yǎng)和溫度等因素刺激后能利用原油為唯一碳源。本研究從原油本身的附生細菌出發(fā)，經(jīng)培養(yǎng)所得W-菌群，從菌群中分離得到一株降解菌Wle-5，并對W-菌群和Wle-5的降解能力進行了研究，從氣相色譜結(jié)果可以看出，W-菌群的降解能力要高于單株降解菌Wle-5，其原因可能是在同一培養(yǎng)基環(huán)境中細菌形成了穩(wěn)定的群落，通過它們之間的協(xié)同作用，使得降解能力更強。

傳統(tǒng)的富集篩選方法只能培養(yǎng)極少數(shù)的微生物［8，9］，同時也破壞了微生物之間的相互作用［10-12］，通過分析環(huán)境樣品的16S rDNA克隆文庫的序列可以實現(xiàn)對樣品中細菌多樣性的研究［13］。本試驗采用分子生物學方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合，研究了原油中自有的微生物。構(gòu)建了原油降解菌的克隆文庫，結(jié)果表明，Proteobacteria類群和Firmicutes類群是文庫中兩大類群，降解菌體系中存在能夠降解原油的微生物，而通過分離純化的方法也得到一株原油降解菌，紫外吸收法對其降解率研究表明其對原油具有明顯的降解效果。氣相色譜分析結(jié)果顯示，Wle-5對某些低沸點飽和烴和部分芳香烴具有明顯降解效果，特別是不同結(jié)構(gòu)的烴類化合物其結(jié)果尤為顯著。

有研究表明，蒼白桿菌屬能有效降解脂肪族和芳香族烴類［14］，脲芽孢八疊球菌的發(fā)酵液有很強排油活性及穩(wěn)定的乳化能力［15］。從氣相色譜和紅外圖譜結(jié)果可以看出，原油中的烴類物質(zhì)發(fā)生了降解，從試驗所拍攝到的混合菌體系的電鏡照片中也可明顯看到類似八疊球菌形狀的細菌，表明原油中仍可能存在新的降解菌。微生物對烷烴的降解主要是在多種酶的催化下進行的，其方式主要包括，末端氧化、亞末端氧化和ω氧化［16-21］。本研究中所分離的降解菌的中紅外結(jié)果表明，烯烴末端甲基和亞甲基被氧化，表明該菌對原油降解也可能是在單加氧酶作用下發(fā)生的。

4 結(jié)論

（1）加入營養(yǎng)物刺激后獲得了原油降解菌體系，該混合菌體系對原油烴類物質(zhì)具有明顯的降解效果。對降解菌體系進行研究表明，降解菌體系生物多樣性較為豐富，含有多種原油降解菌，共同完成原油的降解。Proteobacteria類群和Firmicutes類群為降解菌體系中的主要類群。

（2）從原油中分開得到降解菌Wle-5，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

（3）紅外光譜顯示3 000 cm-1，2 855 cm-11 377 cm-1等處的原油特征峰，降解后振動減弱或消失，原油發(fā)生降解。

（4）氣相色譜和紅外光譜結(jié)果表明，經(jīng) 21 d的降解處理后，原油烴大幅減少。適當延長降解時間，原油中烴類物質(zhì)的降解率增加。

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