小RNA的組成和功能——三類內(nèi)源小RNA的研究概況

李澤 白荷露

（1.呼和浩特職業(yè)學(xué)院生物化學(xué)工程學(xué)院，呼和浩特 010051；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

生物體中RNA可以分成兩大類：編碼RNA和非編碼RNA。非編碼RNA中有許多種小RNA，它們組成了細(xì)胞中高度復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)節(jié)個體發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗病毒等整個細(xì)胞水平的幾乎所有事件中起著重要的調(diào)控作用。

在20世紀(jì)90年代，生物學(xué)家相繼在植物和動物中發(fā)現(xiàn)了正反義雙鏈小RNA導(dǎo)致的內(nèi)源基因沉默的現(xiàn)象。Fire等［1］對這種dsRNA調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)的現(xiàn)象定義了一個名詞——RNA干擾（RNA interference，簡稱RNAi）。隨后，在線蟲、果蠅和擬南芥等多種模式生物中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，RNAi作用機制模型被提出［2］，并且應(yīng)用RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象等研究成果相繼有論文發(fā)表［3］，使RNAi技術(shù)在2002年度《Science》評選的十大科學(xué)成就中名列榜首。自此，RNAi研究已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。RNAi現(xiàn)象是由生物體內(nèi)一類非編碼的雙鏈小RNA所指導(dǎo)，內(nèi)源小RNA種類各異，主要可歸納為3類：微小RNA（microRNA，miRNA），小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）和與piwi相互作用的RNA（piRNA）。關(guān)于miRNA和siRNA的研究起步較早，研究也較為深入，piRNA自2006年發(fā)現(xiàn)后又一次掀起了小RNA研究的熱潮。

1 miRNA的研究

1.1 miRNA的結(jié)構(gòu)特征

人們最早發(fā)現(xiàn)的miRNA是線蟲中的lin-4和Let-7［4，5］，由于它們在發(fā)育時序的控制中發(fā)揮重要作用，因此其最初被稱為小分子時序RNA（small temporal RNA，stRNA）。隨后，科研人員相繼在線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥和水稻等模式生物和細(xì)胞中克隆了上百種類似的非編碼小RNA分子，有些并不是在特定階段表達(dá)，而是在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)，統(tǒng)稱為microRNA。

miRNA是一類長度約22 nt的非編碼單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70-80 nt單鏈RNA前體（pre-miRNA）剪切后生成。它通過與目標(biāo)mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域（3'-untranslated region，3'UTR）互補導(dǎo)致該mRNA分子的翻譯受到抑制。miRNA具有以下結(jié)構(gòu)特征：成熟miRNA的5'端磷酸基團(tuán)或3' 端羥基可以和上游或下游的序列不完全配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；大部分miRNA從前體的一條臂上剪切而來，只有少數(shù)是兩條臂同時剪切產(chǎn)生；miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中而且絕大部分位于基因間隔區(qū)；miRNA在各物種間具高度的進(jìn)化保守性，尤其在莖部結(jié)構(gòu)，表明miRNA各自行使著重要的生物學(xué)功能；miRNA具一定的階段性和組織特異性，即在生物發(fā)育的不同階段或不同組織中表達(dá)不同類型的miRNA［6］。

1.2 miRNA的生物發(fā)生過程

整個miRNA的生物發(fā)生過程貫徹細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，包括pre-miRNA的產(chǎn)生、輸出以及成熟miRNA的生成［7］。細(xì)胞核內(nèi)的miRNA基因在RNA pol II的作用下轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA。pri-miRNA被RNase Ш Drosha剪切成約70 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體——pre-miRNA。pre-miRNA借助轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5從核內(nèi)運輸?shù)桨|(zhì)中，在另一種RNase Ш Dicer作用下被剪切成約22 nt的雙鏈miRNA中間體，即miRNA：miRNA*（miRNA*是miRNA的 互 補 序列）的雙螺旋結(jié)構(gòu)。隨后雙螺旋解旋，其中一條鏈結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中形成非對稱RISC復(fù)合物（asymmetric RISC assembly）［8］，該復(fù)合物能結(jié)合到靶mRNA上，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。

植物miRNA的成熟過程與動物miRNA的成熟過程的不同之處在于植物中沒有Drosha的同源類似物）。在植物中，miRNA的成熟是在Dicer同源異形體DCL1催化下進(jìn)行的，與Drosha功能類似的酶催化pri-miRNA 轉(zhuǎn)變成pre-miRNA，然后在DCL1和其他類似蛋白的作用下，通過對pre-miRNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切，在細(xì)胞核內(nèi)生成中間產(chǎn)物miRNA：miRNA* 雙鏈。在類似Exportin-5功能的HAST-Y協(xié)助下輸出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。最后，經(jīng)過解旋酶的作用成為單鏈的成熟miRNA［6］（圖1）。

1.3 miRNA的作用機制和功能

miRNA能夠通過兩種沉默機制調(diào)控目的基因的表達(dá)：mRNA的切割或翻譯抑制。如果miRNA與mRNA完全互補，miRNA指導(dǎo)mRNA特異性切割；若不完全互補則指導(dǎo)翻譯抑制［6］（圖2）。研究發(fā)現(xiàn)，對于動物而言，miRNA能夠與靶mRNA的3'-UTR不完全配對，從而抑制了該基因的翻譯過程。對于大多數(shù)植物，miRNA能與mRNA的開放閱讀框完全互補配對，從而對mRNA進(jìn)行剪切，使mRNA降解［9］。

研究發(fā)現(xiàn)，許多植物miRNA參與了植物發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控。對擬南芥中的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測后，發(fā)現(xiàn)近70%的靶基因是參與發(fā)育調(diào)控與細(xì)胞分化的基因家族成員，植物miRNA正是通過使特定細(xì)胞中這些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解從而改變植物形態(tài)［10］。

動物miRNA在生物體許多生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如胚胎發(fā)育，細(xì)胞分化、增殖、凋亡，胰島素分泌等過程。近年來研究顯示，miRNA甚至?xí)c一些疾病的形成有關(guān)［11-13］。據(jù)估計，人類基因組中miRNA基因的數(shù)目可能多于總基因數(shù)的1%，根據(jù)miRNA種子序列分析推測人類基因組中約30%的基因受miRNA調(diào)控。表1和表2分別列出了動物中一些已知功能的miRNA［6］和靶分子已知但功能尚不明確的的miRNA［7，10］。

2 siRNA的研究

siRNA也是一種長度為21-25 nt的小RNA，其中包括5個磷酸鹽，2個核苷和3個懸臂，在RNA沉默過程中起中心作用，誘導(dǎo)特定mRNA的降解，這個過程被稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）［14］。雖然siRNA和miRNA非常相似，但是它們的產(chǎn)生途徑、功能以及對靶RNA的作用都是不同的。下面以列表的形式介紹了siRNA和miRNA的主要區(qū)別［7］（表3）。圖1和圖2闡明了siRNA和miRNA生物發(fā)生及作用機制的區(qū)別［10］。

圖1 miRNA和siRNA的生物發(fā)生過程［6］

圖2 miRNA和siRNA的作用機制［6］

大多數(shù)真核生物中都有各種不同類型的小RNA，以模式植物擬南芥為例。擬南芥的siRNA特別復(fù)雜，它含有3種不同于miRNA的內(nèi)源siRNA亞 類：反 式 作 用siRNA（trans-acting siRNAs，tasiRNA），從天然反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物衍生的siRNA（natural siRNAs，nat-siRNA），與重復(fù)序列結(jié)合的siRNA（repeat-associated siRNAs，ra-siRNA）。這3種 小RNA都選擇性地與AGO復(fù)合物結(jié)合。miRNA從不完整的發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，DCL1對發(fā)夾的切割通常產(chǎn)生與AGO1結(jié)合的小RNA。ta-siRNA的生物合成需要有miRNA介導(dǎo)的非編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切割，再由RNA聚合酶6合成dsRNA，最后由DCL4加工形成可與AGO2結(jié)合的21核苷酸小RNA。nat-siRNA由天然反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生，這種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由兩個重疊基因的匯集轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，由DCL2和DCL1加工。擬南芥中最豐富的小RNA是長度為24核苷酸的ra-siRNA，由轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)序列產(chǎn)生，主要與AGO4結(jié)合［15］。

表1 已知功能的miRNAs

表2 部分靶分子已知但功能尚不明確的miRNA

2007年初發(fā)表于《Science》的兩篇關(guān)于siRNA的研究文章中提出了次級siRNA（secondary siRNA）是一種特殊的小RNA群體［16，17］。研究人員發(fā)現(xiàn)，幾個次級siRNA序列開始于一些初級siRNA下游核苷，在表達(dá)錯配單核苷酸初級siRNA的細(xì)胞系中并不復(fù)制這種錯配，但是包含mRNA互補核苷。次級siRNA是唯一攜帶5'雙磷酸鹽和三磷酸鹽，具有反應(yīng)鏈極性（antisense polarity）的siRNA，也是唯一與RDE-1（RNAi特異性argonaute蛋白）相關(guān)聯(lián)的siRNA。因此研究人員推斷次級siRNA是一種不同類型的小RNAs，其產(chǎn)生依賴于RdRP。

表3 siRNA和miRNA的主要區(qū)別

3 piwiRNA的研究

2006年7月，《Nature》和《Science》雜志幾乎同時報道了一類新的非編碼小RNA——piRNA（Piwiinteracting RNA），發(fā)現(xiàn)它們與生殖細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)［18-20］。piRNA是從哺乳動物生殖細(xì)胞中分離得到的一類長度約30 nt的單鏈小RNA，與miRNA和rasiRNA一樣，5'端也具有強烈的尿嘧啶傾向性（約86%），但是piRNA以高度特異鏈的方式主要對應(yīng)于單鏈基因組位點。piRNA的表達(dá)具有組織特異性，調(diào)控著生殖細(xì)胞和干細(xì)胞的生長發(fā)育，目前只在老鼠、果蠅和斑馬魚等哺乳動物的生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這類小分子。piRNA在染色體上的分布極不均勻，主要存在于基因間隔區(qū)，成簇分布在1-100 kb相對較短的基因組位點，幾乎都具有同一取向，說明同一簇piRNA可能來源于同一初始轉(zhuǎn)錄物，但有一部分成簇的piRNA會突然改變?nèi)∠?，說明這些雙向的成簇piRNA可能由相同的啟動子按不同的方式轉(zhuǎn)錄。

piRNA的來源一直是研究人員的研究重點之一。piRNA的生物發(fā)生途徑明顯不同于miRNA和siRNA。研究人員提出了幾種可能的piRNA生源論機制和模型，但是目前的研究還不足以充分解釋piRNA的生物發(fā)生過程，尚需進(jìn)一步的研究。

目前的研究表明，piRNA主要存在于哺乳動物的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中，通過與Piwi亞家族蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物（piRC）調(diào)控基因沉默途徑，piRC在配子發(fā)生過程中起著十分重要的作用。另外，只有17%-20%的哺乳動物piRNA對應(yīng)于標(biāo)記的重復(fù)序列，包括轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。因此，piRNA從后生程序化和抑制轉(zhuǎn)錄到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能有不同的功能。根據(jù)Piwi蛋白已知的功能推測piRNA的功能有3個方面：沉默轉(zhuǎn)錄基因過程；維持生殖系和干細(xì)胞功能；調(diào)節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性［21］。

piRNA的發(fā)現(xiàn)為非編碼小分子RNA的研究開辟了一個新領(lǐng)域。到目前為止，對piRNA的研究已經(jīng)取得了階段性的成果，但要預(yù)測piRNA在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用還為時過早，其中仍然有許多問題需要進(jìn)一步研討。

4 小結(jié)

從小RNA發(fā)現(xiàn)至今，人類對其結(jié)構(gòu)和功能已有了一定程度的了解，并將其應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)和應(yīng)用科學(xué)的研究中。尤其是以siRNA為中心的RNAi技術(shù)已應(yīng)用于功能基因研究，基因治療和藥物開發(fā)等多方面，在HIV感染，肝炎病毒感染及腫瘤等疾病治療中已取得突破性進(jìn)展。因此，人們認(rèn)識到基因組中大量的非編碼區(qū)蘊藏著重要的生命功能活動信息，生物體的一些生長發(fā)育，細(xì)胞的發(fā)生和分化，疾病的產(chǎn)生等都被這些非蛋白編碼的小RNA所調(diào)控。目前人類所了解的小RNA只是全部小RNA的冰山一角。毫無疑問，細(xì)胞中還有大量的非編碼RNA未被發(fā)現(xiàn)，許多已發(fā)現(xiàn)的小RNA 的功能還有待進(jìn)一步探索，它們將是生命科學(xué)領(lǐng)域里新的研究熱點。對包括miRNA 在內(nèi)的所有小分子RNA的深入研究將有助于人類揭示更多生命的奧秘。

［1］ Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature, 1998, 391（6669）：806-811.

［2］ Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al. RNAi：double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals［J］. Cell, 2000, 101（1）：25-33.

［3］ Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］. Nature, 2001, 411（6836）：494-498.

［4］ Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］. Cell, 1993, 75（5）：843-854.

［5］ Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, et al. The 21 nucleotide Let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］. Nature, 2000, 403：901-906.

［6］ Lu JJ, LiaoWB, Peng M. The Progress of MicroRNA Research［J］. Molecular Plant Breeding, 2006, 4（6）：73-77.

［7］ 湯華. RNA干擾原理與應(yīng)用［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2006.

［8］ Hua YJ, Xiao HS. Progresses on the microRNA study［J］. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2005, 17（3）：278-281.

［9］ 伍林濤, 阮穎, 彭琦, 等. miRNA研究進(jìn)展［J］. 作物研究, 2006（5）：572-576.

［10］ Bartel DP. MicroRNAs：genomics, review：biogenesis, mechanism, and function［J］. Cell, 2004, 116（2）：281-297.

［11］ Pasquinell AE, Ruvkun G. Control of developmental timing by micrornas and their targets［J］. Cell and Developmental Biology, 2002. 18：495-513.

［12］ Ambros V. The functions of animal microRNAs［J］. Nature, 2004, 431：350-355.

［13］ Yu Z, Li Z, Jolicoeur N, et al. Aberrant allele frequencies of the SNPs located in microRNA target sites are potentially associated with human cancers［J］. Nucleic Acids Res, 2007, 35（13）：4535-4541.

［14］ 何晨, 譚軍, 陳薇. MicroRNA 的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報, 2006（1）：18-21.

［15］ Kim VN. Sorting out small RNAs［J］. Cell, 2008, 133（1）：25-26.

［16］ Pak J, Fire A. Distinct populations of primary and secondary effectors during RNAi in C. elegans［J］. Science, 2007, 315（5809）：241-244.

［17］ Sijen T, Steiner FA, Thijssen KL, et al. Secondary siRNAs result from unprimed RNA synthesis and form a distinct class［J］. Science, 2007, 315（5809）：244-247.

［18］ Lau NC, Seto AG, Kim J. Characterization of the piRNA complex from rat testes［J］. Science, 2006, 313（5785）：363-367.

［19］ Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI proteinin mouse testes［J］. Nature, 2006, 442（7099）：203-207.

［20］ Girard A, Sachidanandam R, Hannon GJ, et al. Agermline specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins［J］. Nature, 2006, 442（7099）：199-202.

［21］ 黃雪梅, 張守濤. piRNA：一類新的非編碼小RNA［J］. 中國生物工程雜志, 2008, 28（8）：130-135.