SC-04抗生素的生物活性測(cè)定

李文斌 李增波 劉仙俊

（太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，太原 030021）

生物農(nóng)藥易被自然界分解而不污染環(huán)境，能耗低、投資少，因此，利用微生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)作為開發(fā)生物農(nóng)藥的研究受到了世界各國(guó)的極大重視［1-3］。近年來，阿維霉素在農(nóng)業(yè)上的成功應(yīng)用，引起了人們對(duì)農(nóng)用抗生素開發(fā)的濃厚興趣［4，5］。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的菌樣進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn)、離體組織和大田測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SC-04菌發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉、草莓枯萎等園藝作物病害具有良好的防治效果。本研究通過對(duì)SC-04菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析及其抗菌物質(zhì)的極性分析，優(yōu)化其生物活性物質(zhì)SC-04抗生素的分離提取方法，對(duì)抑菌譜進(jìn)行分析，研究對(duì)辣椒早疫病菌和辣椒疫霉病菌等大多數(shù)病原真菌的抑制效果，旨在為開發(fā)其利用價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗生素產(chǎn)生菌 SC-04菌發(fā)酵液。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 種子培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖10，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨3，CaCO32，水1 000 mL，pH7.2。

1.1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 黃豆粉34，淀粉10，蔗 糖2，魚 粉10，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO32，ZnSO40.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，NaCl 2，水1 000 mL，pH7.2。

1.1.3 主要試劑 分析純甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均由天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)；青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素均由華北制藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.1.4 靶標(biāo)菌 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）；辣椒早疫病菌（Alternaria solani）；小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）；葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）；黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）；西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）；葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）；煙草赤霉病菌（Fusarium graminearum）；水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）；白菜炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum Sacc）；白菜黑斑病菌（Alternaria brassicicola）；番茄黑霉病菌（Botrytis cinerea）；番茄灰霉病菌（Botrytis cinere）；棉花枯萎病菌（F. f. sp. vasinfectum）；草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporium Schl）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）；埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）；青霉（Penicillium）；黑曲霉（Aspergillus niger）。以上菌種均由本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購得。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性分析

1.2.1.1 時(shí)間穩(wěn)定性測(cè)定 將SC-04菌株發(fā)酵濾液于常溫下保存1、7、30和90 d，以辣椒疫霉為病原指示菌，以發(fā)酵原液作為對(duì)照，以生長(zhǎng)速率法即抑菌活性試驗(yàn)測(cè)定其相對(duì)抑菌率（%）［20，21］，根據(jù)活性損失率來確定保存時(shí)間穩(wěn)定性。

1.2.1.2 熱穩(wěn)定性測(cè)定 將SC-04菌株發(fā)酵濾液于70℃和100℃下分別處理10、30和60 min，同時(shí)在121℃下處理30 min，以辣椒疫霉為病原指示菌，以發(fā)酵原液作為對(duì)照，參照前述生長(zhǎng)速率法測(cè)定其相對(duì)抑菌率（%），根據(jù)活性損失率來確定其熱穩(wěn)定性。

1.2.1.3 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 將SC-04菌株發(fā)酵濾液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)整pH為1-14，25℃下保存6 h后再調(diào)回初始pH（8.3），以辣椒疫霉為病原指示菌，以發(fā)酵原液作為對(duì)照，參照前述生長(zhǎng)速率法測(cè)定其相對(duì)抑菌率（%），根據(jù)活性損失率來確定其酸堿穩(wěn)定性。

1.2.1.4 UV穩(wěn)定性測(cè)定 將SC-04菌株發(fā)酵濾液與培養(yǎng)基按1∶10的比例混合，待平板凝固后，在超凈臺(tái)上用紫外燈照射20 min，以辣椒疫霉為病原指示菌，以未照紫外線的平板作為對(duì)照，參照前述生長(zhǎng)速率法測(cè)定其相對(duì)抑菌率（%），根據(jù)活性損失率來確定其酸堿穩(wěn)定性。

1.2.2 抗菌物質(zhì)極性分析 將100 mL發(fā)酵上清液加入等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇的三角瓶中，于室溫置于搖床振蕩，充分混合。靜置過夜，分別測(cè)定上層有機(jī)相和下層水相的抑菌活性。

1.2.3 抑菌譜測(cè)定 將發(fā)酵粗提物用甲醇溶解后，采用濾紙片法進(jìn)行粗提物的活性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性分析

2.1.1 常溫下的穩(wěn)定性 發(fā)酵濾液常溫保存較長(zhǎng)時(shí)間活性損失很小，保存90 d時(shí)，活性損失率僅為14.8%（表1），說明SC-04菌株常溫下穩(wěn)定性較好。

表1 不同保存時(shí)間的發(fā)酵液抑菌率

2.1.2 熱穩(wěn)定性 SC-04菌株發(fā)酵液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。隨著各溫度（70℃和100℃）熱處理時(shí)間延長(zhǎng)，活性損失率呈升高趨勢(shì)；在70℃和100℃下處理10 min，活性損失率分別為14.6%和19.4%，二者相比差距不大，與對(duì)照相比，活性損失不顯著；121℃下處理30 min活性損失率為63.3%，與對(duì)照相比，活性損失較大（表2）。因此，發(fā)酵液的預(yù)處理應(yīng)控制在合適的溫度和時(shí)間內(nèi)。

表2 不同熱處理的發(fā)酵濾液抑菌率

2.1.3 酸堿穩(wěn)定性 由表3可知，SC-04菌株發(fā)酵液在pH4.0-12.0以內(nèi)活性差異不大，其活性損失率不超過20%；與對(duì)照相比，當(dāng)酸堿度過高時(shí)，即在pH<3.0或pH>12.0時(shí)活性損失率明顯提高。因此，在不影響活性的前提下，可通過控制發(fā)酵液的酸堿度來改變發(fā)酵液的流變性，以利于對(duì)SC-04菌株發(fā)酵產(chǎn)物有效組分的分離提取工作的進(jìn)行。

表3 不同pH的發(fā)酵濾液抑菌率

2.1.4 UV穩(wěn)定性 發(fā)酵液經(jīng)紫外線（UV）照射后抑菌率為75.7%，未經(jīng)UV照射的抑菌率為76.4%，其抑菌情況見圖1。當(dāng)發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射30 min后，抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性有所下降，但影響不大，該活性物質(zhì)對(duì)紫外線基本穩(wěn)定。

圖1 UV穩(wěn)定性結(jié)果

2.2 發(fā)酵液預(yù)處理方法的建立

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液除含有所需要抗生素外，還存在大量的菌體和各種代謝產(chǎn)物等，這些雜質(zhì)不僅使發(fā)酵液黏度增高，而且還會(huì)影響后續(xù)的提取操作。為改善發(fā)酵液的流變特性，同時(shí)除去對(duì)后續(xù)純化操作有影響的雜質(zhì)，常常需要預(yù)處理。發(fā)酵液中還含有某些無機(jī)鹽，會(huì)直接影響成品質(zhì)量（灰分增高），因此預(yù)處理也應(yīng)將有影響的無機(jī)離子，特別是高價(jià)金屬無機(jī)離子，如Ca2+、Fe3+和Mg2+除去。從該發(fā)酵液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果來看，該菌株有較好的熱和酸堿穩(wěn)定性，因此將原始發(fā)酵液5 000 r/min離心得上清液，上清液用草酸調(diào)pH到6.0，70℃下處理10 min，離心沉淀得發(fā)酵上清液。

2.3 抗菌物質(zhì)的極性分析

發(fā)酵上清液的萃取結(jié)果（表4）表明，發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)能溶于氯仿、乙酸乙酯等極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，且乙酸乙酯的萃取效果更好，而不溶于非極性溶劑石油醚和強(qiáng)極性溶劑正丁醇。根據(jù)相似相溶原理，可大致判斷該抗菌物質(zhì)極性較強(qiáng)，同時(shí)發(fā)酵上清液萃取試驗(yàn)結(jié)果顯示，活性物質(zhì)既能溶于水又能溶于溶媒，是一種脂溶-水溶性抗生素，一般可采用脂溶性抗生素提取。鑒于該物質(zhì)能被氯仿和乙酸乙酯萃取，且乙酸乙酯比氯仿萃取效果好，確定發(fā)酵上清液可以采用乙酸乙酯為溶劑進(jìn)行萃取。

表4 發(fā)酵液上清萃取試驗(yàn)結(jié)果

2.4 抗菌粗提物的抑菌譜測(cè)定

SC-04發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌譜很廣，其對(duì)大多數(shù)病原真菌都有較好的抑制效果，抑菌圈直徑都在10 mm以上，其中辣椒早疫病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌圈直徑分別為32 mm和30 mm（表5）。

3 討論

農(nóng)用抗生素是現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)工程結(jié)合發(fā)展的產(chǎn)品，易被土壤微生物分解而不污染環(huán)境，對(duì)人畜安全，選擇性高，在農(nóng)業(yè)病蟲害的防治上具有廣闊的發(fā)展前途［6-10］。由于自然界微生物種類繁多，從中尋找有特殊生理活性的物質(zhì)還有很大潛力。農(nóng)用抗生素由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，在抗生發(fā)酵液中，除抗生活性物質(zhì)外還含有很多其它物質(zhì)［11，12］。因此還必須對(duì)其進(jìn)行分離純化來進(jìn)一步研究其各種理化性質(zhì)。目前抗生素的提取精制方法有吸附法、溶媒萃取法、離子交換法、沉淀法外，還經(jīng)常采用逆流分配法、色譜法、高壓液相層析等分離純化方法［13-17］。對(duì)抗生素進(jìn)行分離純化之前，應(yīng)對(duì)抗菌有效成分做一些初步試驗(yàn)，了解其熱、酸堿穩(wěn)定性及UV穩(wěn)定性，判斷其電離特征等［19-21］，在確保分離純化過程中活性成分不失活的前提下，確定其最佳分離提取方法。

表5 SC-04號(hào)粗取物的抑菌譜

4 結(jié)論

通過SC-04菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析，確定了發(fā)酵液的預(yù)處理方法。將原始發(fā)酵液5 000 r/min離心得上清液，上清液用草酸調(diào)pH至6.0，70℃條件下處理10 min，離心沉淀得發(fā)酵上清液?？咕镔|(zhì)的極性分析確定乙酸乙酯為該抗生活性物質(zhì)的最佳提取溶劑。該抗生物質(zhì)抑菌譜較廣，對(duì)辣椒早疫病菌和辣椒疫霉病菌等大多數(shù)病原真菌都有較好的抑制效果，且抑菌活性較強(qiáng)。

［1］ 陳代杰.微生物藥物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社, 2001.

［2］ 陳秀奇.新型生物農(nóng)藥氨苷霉素的分離工藝及其結(jié)構(gòu)鑒定［D］.杭州：浙江大學(xué), 2003.

［3］ 劉秋.抗真菌生物農(nóng)藥-凱地菌素的研究［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2002.

［4］ 王成霞.農(nóng)用抗生素8832＃的發(fā)酵制備及活性組分分離提取方法研究［D］.天津：南開大學(xué), 2000.

［5］ 劉明周.農(nóng)用抗生素94166-Ⅱ、94166-Ⅲ的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定［D］.上海：華東理工大學(xué), 2002.

［6］ 劉茂田.農(nóng)抗9512-2的分離分析及生物理化特性的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

［7］ 王浩.一種抗真菌新抗生素的研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué), 1997.

［8］ 董立.拮抗鏈霉菌Men-myco-93-63的復(fù)壯及其抗生素的提取純化［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2002.

［9］ 伍學(xué)綱.農(nóng)用抗生素94166-Ⅳ、Ⅴ的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定［D］.上海：華東理工大學(xué), 2002.

［10］ 《中華人民共和國(guó)藥典》［M］.（1977年版）.

［11］ 劉泉勇, 胡江春, 薛德林, 等.海洋細(xì)菌LU-B02生物活性物質(zhì)發(fā)酵條件及理化性質(zhì)研究［J］.微生物學(xué)雜志, 2001, 21（1）：10-12.

［12］ 劉光燁, 林洋.膠胨狀芽孢桿菌拮抗菌株活性物質(zhì)形成條件及其性質(zhì)初步研究［J］.微生物學(xué)通報(bào), 2003, 30（1）：22-26.

［13］ 張瑞平.菌株S15發(fā)酵條件、抗生素提取及對(duì)白菜黑斑病防治效果的初步研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001.

［14］ 李海濤.農(nóng)抗武夷菌素的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定［D］.北京：協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2001.

［15］ 胡志鈺.海洋動(dòng)植物共附生放線菌農(nóng)抗活性物質(zhì)的初步研究［D］.廈門：廈門大學(xué), 2001.

［16］ 李銘剛, 文孟良, 李一青.薄層層析指導(dǎo)下的嗜堿放線菌菌株YIMGQ-14次生代謝產(chǎn)物研究［J］.微生物學(xué)報(bào), 2003, 4（3）：481-486.

［17］ 夏海洋.農(nóng)抗A<9901>-I素分離鑒定及生物理化特性研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2002.

［18］ 顧覺奮.分離純化工藝原理［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2000.

［19］ 顧學(xué)斌, 陶黎明, 徐文平.磷氮霉素PN-2的分離鑒定及活性研究初報(bào)［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 4（1）：75-79.

［20］ 劉秋, 于基成, 劉長(zhǎng)建.龜裂鏈霉菌菌株MY02發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性測(cè)定［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 43（1）：51-54.

［21］ 劉曉妹, 陳秀蓉, 蒲金基.兩株芽孢桿菌無菌液抗菌譜及穩(wěn)定性測(cè)定［J］.中國(guó)生物防治, 2003, 19（4）：141-143.