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    基因組重排選育Epothilone B高產(chǎn)菌株

    2013-12-23 05:12:10王大紅劉飛
    生物技術(shù)通報(bào) 2013年5期
    關(guān)鍵詞:高產(chǎn)產(chǎn)量融合

    王大紅 劉飛

    (1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,洛陽 471023;2.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,南陽 473061)

    Epothilone B是由德國生物技術(shù)研究中心首次從纖維堆囊菌分離得到的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物[1],該物質(zhì)能促進(jìn)微管蛋白聚合,水溶性好,其活性是紫杉醇的2 000-3 000倍[2-4]。目前,美國、瑞士等國開始從事相關(guān)研究,而我國主要是山東大學(xué)、華南理工等機(jī)構(gòu)做了一些相關(guān)研究。2007年由美國施貴寶公司開發(fā)的Epothilone B內(nèi)酰胺衍生物Ixabepilone獲得FDA批準(zhǔn)在美國上市,這是第一個(gè)上市的Epothilones衍生物,每毫克大約70美元[5]。目前纖維堆囊菌So.ce 90菌的產(chǎn)量低,雖然在發(fā)酵過程中通過補(bǔ)料方式或不斷更新吸附樹脂可以提高Epothilones類似物的產(chǎn)量,但是毫克級的產(chǎn)量給Epothilones的開發(fā)及應(yīng)用帶來了很大困難[6]。因此,菌種的篩選、選育及發(fā)酵條件的探索仍然是Epothilone B研究者需要研究的重點(diǎn)目標(biāo)之一。

    基因組重排(genome shuffling)是一種基于原生質(zhì)體融合,并對原生質(zhì)進(jìn)行遞推式融合的新型體內(nèi)分子育種方法。2002年,Zhang等[7]首次系統(tǒng)地提出了基因組重排的概念并成功地將該技術(shù)運(yùn)用于快速提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力。隨后,Gendy等[8]采用基因組重排技術(shù)選育綾霉素的產(chǎn)生菌Nocardia sp. ALAA 2000,選育后綾霉素比起始菌株提高了19倍。Xu等[9]利用該技術(shù)使Trichoderma viride產(chǎn)纖維素酶的能力提高了1.97倍。隨著基因組重排技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟,通過基因組重排提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的例子不斷出現(xiàn),表明該項(xiàng)技術(shù)作為新代謝產(chǎn)物開發(fā)的途徑具有一定的應(yīng)用前景。本研究旨在采用基因組重排技術(shù)改良Epothilone B產(chǎn)生菌,選育出高產(chǎn)Epothilone B的優(yōu)良變異菌株,研究結(jié)果具有一定的理論和實(shí)際意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 親本菌株SC4-14和SC4-56是由纖維堆囊菌AHB125(S. cellulosum AHB125)經(jīng)過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選出來并保存的Epothilone B高產(chǎn)菌株[10]。

    1.1.2 培養(yǎng)基和溶液 斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基參見參考文獻(xiàn)[10]。

    再生固體培養(yǎng)基(g/L):蔗糖171.5,MgCl24.273,酪胨3.0,酵母浸膏1.0,CaCl21.0,瓊脂粉16.0,pH7.2-7.4。

    HEPES緩 沖 液:HEPES 20 mmol/L,MgCl220 mmol/L,蔗糖0.5 mol/L,pH6.8,滅菌備用。

    溶菌酶溶液:稱取0.1 g溶菌酶,加入HEPES緩沖液溶解并定容至10 mL,過濾除菌,4℃保存,使用時(shí)稀釋。

    35% PEG4000溶液(W/V):PEG4000定容于100 mL HEPES緩沖液。

    1.2 方法

    1.2.1 Epothilone B的發(fā)酵與測定 Epothilone B的發(fā)酵與測定見參考文獻(xiàn)[10]。Epothilone B的測定采用HPLC法,通過Epothilone B的保留時(shí)間和光吸收曲線對基因組重排后的高產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的Epothilone B進(jìn)行定性。

    1.2.2 原生質(zhì)體的制備及再生 菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長期(48 h)時(shí),加入終濃度為0.01 mol/L EDTA和1%甘氨酸,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取一定量培養(yǎng)好的菌液,1 000 r/min離心5 min,取上清液5 000 r/min再離心10 min并收集菌體,HEPES緩沖液洗滌2次,將菌體保存在5 mL HEPES緩沖液中。然后加入溶菌酶液并混勻,使其終濃度為5 mg/mL,37℃水浴保溫酶解破壁1 h,定時(shí)鏡檢。酶解后,3 000 r/min離心10 min并收集原生質(zhì)體,用等體積的HEPES液重懸,振蕩混勻,離心棄上清,再用HEPES液洗滌1次,等體積重懸,與冷卻至45℃左右的上層再生固體培養(yǎng)基混勻,傾入已孵育過夜的再生固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)5-7 d,觀察再生情況。

    1.2.3 原生質(zhì)體的滅活 紫外線滅活:將原生質(zhì)體溶液移入無菌培養(yǎng)皿中,置于已預(yù)熱穩(wěn)定的15 W紫外燈下,垂直距離為30 cm,分別照射60、70、80、90、100、110和120 s進(jìn)行滅活,經(jīng)HEPES緩沖液10倍系列稀釋后,涂布于再生平板上,30℃避光培養(yǎng)5-7 d,檢查滅活效果。

    熱滅活:將原生質(zhì)體溶液置于無菌離心管中,置于溫度分別為55、60、65和70℃水浴鍋中,保溫10、15、20、25和30 min進(jìn)行滅活,經(jīng)HEPES緩沖液10倍系列稀釋后,涂布于再生平板上,30℃避光培養(yǎng)5-7 d后,觀察結(jié)果,檢查滅活效果。

    1.2.4 基因組重排 對親本株SC4-14的原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活,對親本株SC4-56的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外滅活,將滅活的原生質(zhì)體用35% PEG4000(含0.02 mol/L CaCl2)在37℃條件下隨機(jī)融合20 min。然后用5倍體積的HEPES緩沖液稀釋,并3 000 r/min離心5 min,收集原生質(zhì)體后稀釋并涂布于再生培養(yǎng)基上再生,30℃培養(yǎng)3-7 d,全部再生菌落即為F1代融合菌群;將生長旺盛的融合子菌落轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h,檢測發(fā)酵液中Epothilone B的含量,產(chǎn)量提高的突變株為第1輪融合株F1,再將產(chǎn)量較高的優(yōu)良菌株(F1)進(jìn)行下一輪原生質(zhì)體制備、滅活、融合與篩選,所得突變株即F2。如此反復(fù)進(jìn)行4 輪循環(huán)原生質(zhì)體融合、再生,不同融合子代標(biāo)記為F1、F2、F3和F4,同時(shí)以原始菌株做對照。

    1.2.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性的測定 將生產(chǎn)能力較高的幾株菌接種至固體培養(yǎng)基中傳代10次并進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),檢測Epothilone B的含量,選擇遺傳穩(wěn)定性較好、產(chǎn)量穩(wěn)定的重組菌株作為高產(chǎn)重組菌株。

    1.2.6 發(fā)酵過程曲線的測定 將親本菌株與基因重排后的菌株種子液以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,分別于發(fā)酵的第1、2、3、4、5、6、7和8天取樣,分別測定其菌體生長曲線和EpothiloneB含量,繪制其發(fā)酵過程曲線。其中生長曲線采用分光光度計(jì)測定在OD600下的吸光值,EpothiloneB含量測定采用HPLC法。

    2 結(jié)果

    2.1 原生質(zhì)體的制備和再生

    在試驗(yàn)過程中需要對原生質(zhì)體制備的影響條件進(jìn)行考察。經(jīng)過前期的研究確定溶菌酶最終質(zhì)量濃度為4 mg/mL、酶解溫度為37℃、酶解時(shí)間為60 min,在此條件下原生質(zhì)體的形成率和再生率最高。

    2.2 原生質(zhì)體滅活

    2.2.1 熱滅活原生質(zhì)體 從表1 可見,當(dāng)菌株SC4-14原生質(zhì)體在70℃恒溫水浴中處理20 min 時(shí),原生質(zhì)體致死率達(dá)到100%。但當(dāng)溫度超過65℃時(shí),原生質(zhì)體容易黏結(jié)成團(tuán),不利于原生質(zhì)體的融合。因此,本試驗(yàn)確定60℃、處理25 min 作為Epothilone B產(chǎn)生菌原生質(zhì)體熱滅活的條件。

    表1 熱滅活時(shí)間和溫度對SC4-14原生質(zhì)體致死率的影響

    2.2.2 紫外線滅活原生質(zhì)體 從圖1可以看出,當(dāng)紫外線照射SC4-56的原生質(zhì)體時(shí)間為110 s 時(shí),原生質(zhì)體致死率為100%。因此,選用紫外線照射110 s 作為Epothilone B產(chǎn)生菌原生質(zhì)體紫外滅活的處理時(shí)間。

    圖1 紫外線滅活時(shí)間對SC4-56原生質(zhì)體致死率的影響

    2.3 基因組重排

    為獲得更多重排的正突變基因組合,選用兩個(gè)親株SC4-14和SC4-56作為基因重排的出發(fā)親本,這2個(gè)親本是由S. cellulosum AHB125經(jīng)過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選而獲得的。經(jīng)過4輪基因組重排試驗(yàn)后,獲得62株生長速度較快的菌株,對得到的重排菌株進(jìn)行產(chǎn)量測定,得到8株產(chǎn)量相對較高的重組菌株。從圖2中可以看出,原始菌株S. cellulosum AHB125 Epothilone B的產(chǎn)量為8.2 mg/L,制備原生質(zhì)體的兩株親本菌株SC4-14和SC4-56的Epothilone B產(chǎn)量分別為13.6 mg/L和14.5 mg/L。獲得的8株高產(chǎn)菌株其Epothilone B的產(chǎn)量都是SC4-14和SC4-56菌株的2倍以上,并且菌落形態(tài)和顏色與起始菌株相比沒有發(fā)生明顯變化。其中F4-13(58.8 mg/L) 和F4-28(67.4 mg/L)的產(chǎn)量最高,Epothilone B的產(chǎn)量是SC4-14菌株產(chǎn)量的4.3倍和5.0倍,是SC4-56菌株產(chǎn)量的4.1倍和4.6倍,是原始菌株纖維堆囊菌AHB125 Epothilone B產(chǎn)量的8倍。

    圖2 基因組重排篩選結(jié)果

    2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

    將篩選出的8株高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代10次后,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),以搖瓶的產(chǎn)量作為篩選的指標(biāo),結(jié)果(表2)顯示,傳代后的菌株發(fā)酵產(chǎn)量沒有明顯下降,表明篩選到的重排菌株的高產(chǎn)性狀遺傳特性較穩(wěn)定。F4-6、F4-45和 F4-56的產(chǎn)量有明顯下降,其遺傳穩(wěn)定性差;而其它5株的遺傳性穩(wěn)定性較好,其中F4-28的產(chǎn)量最高,Epothilone B的產(chǎn)量一直穩(wěn)定在67 mg/L左右。

    表2 重組菌株的Epothilone B產(chǎn)量(mg/L)

    2.5 菌株SC4-56和F4-28在10 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程比較

    將親本菌株之一SC4-56和重排菌株F4-28在10 L發(fā)酵罐上分別進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),其發(fā)酵過程曲線如圖3所示。兩種菌株在發(fā)酵過程中的生長曲線大致相似,都在第3天達(dá)到菌體的最大值,但重排菌株F4-28的細(xì)胞密度要大于親本菌株,并提前進(jìn)入衰亡期。在Epothilone B積累過程中,兩者在發(fā)酵罐中的產(chǎn)量都比在搖瓶中要高約10%,SC4-56在第6天產(chǎn)物達(dá)到最大值(18.5 mg/L),而F4-28在發(fā)酵的第5天達(dá)到最大值(75.2 mg/L),比親本菌株的發(fā)酵周期要短1 d。因此,重排菌株F4-28在發(fā)酵生產(chǎn)上更易于提高發(fā)酵罐的利用效率。

    圖3 SC4-56和F4-28在10 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程曲線

    3 討論

    采用物理、化學(xué)方法來提高Epothilone B產(chǎn)量的傳統(tǒng)誘變育種方法存在誘變效率低、篩選工作量大、周期長、重復(fù)誘變過程造成一些無關(guān)的或負(fù)向突變的積累等缺點(diǎn),很難大幅度提高Epothilone B產(chǎn)量;而由于黏細(xì)菌的特殊性,通過基因工程提高Epothilone B的方法很少被研究[11]?;蚪M重排技術(shù)是一種多親本遞歸式原生質(zhì)體融合技術(shù),親本菌株在全基因組的不同位置上同時(shí)發(fā)生重組,發(fā)生多交換和多基因重組,最終使不同的正向基因重組到同一個(gè)細(xì)胞株中,因此相對容易大幅度提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量,是改善工業(yè)微生物表型的直接而有效的方法[12]。另外,尤其適用于微生物的代謝途徑、編碼生物合成酶的基因以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制不清楚的代謝產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的理化誘變方法相比,基因組重排技術(shù)可更快速、高效地篩選出表型優(yōu)良的菌株,且在篩選庫的建立過程中剔除了負(fù)突變,彌補(bǔ)了經(jīng)典誘變方法負(fù)突變的缺陷[13]。

    本研究中采用熱滅活和紫外滅活兩種方式處理原生質(zhì)體,然后再融合,這樣避免了同種滅活方式造成的相同部位發(fā)生損傷的缺陷,使不同菌株間染色體不同部位的致死損傷可以得到互補(bǔ),從而提高了重組的效率。本研究首次嘗試采用基因組重排技術(shù)改良纖維堆囊菌AHB125,獲得一株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株F4-28,Epothilone B的產(chǎn)量達(dá)到了67.4 mg/L,是原始菌株纖維堆囊菌AHB125的8倍,是兩親本菌株SC4-14和SC4-56的5倍。因此,采用基因組重排技術(shù)是一種有效的提高Epothilone B產(chǎn)量的方法。雖然本研究取得了很大的進(jìn)步,但是Epothilone B的產(chǎn)量與目前已報(bào)道菌株S. cellulosum So0157-2的產(chǎn)量(104 mg/L)相比還有較大差距[14]。這主要是因?yàn)楸狙芯克玫木陙碓磁c其不同,纖維堆囊菌AHB125是由本實(shí)驗(yàn)室研究人員從自然界中分離并鑒定的,其初始產(chǎn)量很低,并且前期的菌種選育研究的較少,而S. cellulosum So0157-2已經(jīng)過多次誘變。因此,在下一步的工作中,應(yīng)該把基因組重排與其它誘變育種技術(shù)聯(lián)合使用,Epothilone B的產(chǎn)量可能會(huì)更高。同時(shí),本研究也再次證明了基因重排技術(shù)在菌種選育中的有效性及高效性,同時(shí)為應(yīng)用該技術(shù)選育高產(chǎn)Epothilone B菌株和研究Epothilone B的代謝調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。

    4 結(jié)論

    采用基因組重排的方法對Epothilone B產(chǎn)生菌纖維堆囊菌SC4-14和SC4-56進(jìn)行菌株選育,獲得5株目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)量較高并且遺傳性能穩(wěn)定的變異菌株,其中最優(yōu)菌株F4-28的Epothilone B產(chǎn)量達(dá)到了67.4 mg/L,是兩親本菌株SC4-14和SC4-56的5倍,通過比較該菌株與親本菌株之一SC4-56的發(fā)酵過程,F(xiàn)4-28的Epothilone B產(chǎn)量在第5天達(dá)到最大值,比SC4-56的發(fā)酵周期少1 d,可以縮短發(fā)酵周期。

    [1] Gerth K, Bedorf N, Hofle G, et al. Epothilones A and B:antifungal and cytotoxic compounds from Sorangium cellulosum (Myxobacteria):production, physico-chemical and biological properties [J]. Journal Antibiotics, 1996, 49(3):560-563.

    [2] Whitney H, Juwen D, Quincy Q. The microtubule inhibiting agent epothilone B antagonizes glioma cell motility associated with reorganization of the actin-binding protein α-actinin 4 [J]. Oncology Reports, 2011, 25(3):887-893.

    [3] Kumar A, Heise H, Blommers M, et al. Interaction of Epothilone B (Patupilone) with microtubules as detected by two-dimensional solid-state NMR spectroscopy [J]. Angewandte Chemie, 2010, 49(41):7504-7507.

    [4] Danishefsky S. On the potential of natural products in the discovery of pharma leads:A case for reassessment [J]. Natural Product Reports, 2010, 27:1114-1116.

    [5] Harichand-Herdt S, O’Regan RM. Identifying subsets of metastatic breast cancer patients likely to benefit from treatment with the Epothilone B analog Ixabepilone [J]. American Journal of Clinical Oncology, 2010, 33(6):561-567.

    [6] Frykman S, Tsuruta H, Lau J, et al. Modulation of epothilone analog production through media design [J]. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 2002, 28(1):17-20.

    [7] Zhang YX, Perry KA, Vinci V, et al. Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria [J]. Nature, 2002, 6872:644-646.

    [8] Gendy M, Bondkly A. Genome shuffling of marine derived bacterium Nocardia sp. ALAA 2000 for improved ayamycin production [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2011, 99(4):773-780.

    [9] Xu F, Jin H, Li H, et al. Genome shuffling of Trichoderma viride for enhanced cellulase production [J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(2):509-515.

    [10] 王大紅, 原江鋒, 郭文杰.產(chǎn)Epothilone B纖維堆囊菌的選育與發(fā)酵優(yōu)化[J].生物技術(shù), 2012, 22(3):70-72.

    [11] Julien B, Shah S. Heterologous expression of epothilone biosynthetic genes in Myxococcus xanthus [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, 46(9):2772-2778.

    [12] Petri R, Claudia SD. Dealing with complexity:evolutionary engineering and genome shuffling [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15(4):298-304.

    [13] 張旭, 張惠文, 徐明愷.基因組重排技術(shù)選育乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株[J].中國生物制品學(xué)雜志, 2010, 23(10):1065-1073.

    [14] Gong G, Sun X, Liu X, et al. Mutation and a high-throughput screening method for improving the production of Epothilones of Sorangium [J]. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 2007, 34(9):615-623.

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