蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)HSC-T6細(xì)胞差異蛋白質(zhì)分析

徐瑾 張學(xué)榮 胡仁統(tǒng) 羅小玲 陳纓 林興 廖明 付嬈 付道瀅

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理途徑，其發(fā)生發(fā)展過程中涉及到多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間一系列復(fù)雜的變化，主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的過度合成與異常沉積。肝星狀細(xì)胞（HSC）是參與該過程的最重要細(xì)胞，HSC的活化、增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，抑制HSC增殖、誘導(dǎo)其凋亡是抗肝纖維化的重要策略［1］。近年來，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）誘導(dǎo)HSC凋亡現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)［2］使其有望從神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域應(yīng)用到肝纖維化的治療中。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）作為后基因時(shí)代研究的一個(gè)重要內(nèi)容，其理論和技術(shù)的發(fā)展完善亦為肝纖維化的研究帶來了新的思維方式和研究領(lǐng)域。將這種高通量的研究策略引用到肝纖維化發(fā)生過程中，能夠在一個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)中同時(shí)研究多種蛋白質(zhì)的變化，有助于全面闡明肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中各種蛋白質(zhì)的變化情況［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NGF對(duì)HSC-T6 增殖具有抑制作用，并能夠促進(jìn)其凋亡［4］。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)運(yùn)用雙向凝膠電泳（2-DE）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等技術(shù)對(duì)眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）干預(yù)大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，并分析部分差異蛋白的類型、功能以及在信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用，進(jìn)一步在蛋白水平上揭示人類肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程及NGF抗肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

眼鏡蛇蛇毒NGF由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供；大鼠HSC-T6購(gòu)于湖南湘雅醫(yī)學(xué)院；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自HYCLONE公司，胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；HSC-T6細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清+1%雙抗的DMED培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）培養(yǎng)。雙向電泳和質(zhì)譜所用試劑購(gòu)自Promega公司，CHAPS、碘乙酰胺、硫脲、17 cm固相pH梯度（IPG）干膠條（pH3-10）、固相pH梯度膠條緩沖液（IPG buffer pH3-10）、兩性電解質(zhì)（Pharmalyte，pH3-10）、硝酸銀、Nuclease Mix、IPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALT Six 垂直電泳儀、高分辨的圖像掃描儀和凝膠斑點(diǎn)采集儀（Picker）購(gòu) 于Bio-Rad公 司。點(diǎn) 樣 儀（Digester）、MALDITOF-TOF及圖像分析軟件Image Master2-DE Elite為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品。所有試劑用去離子水配置。

1.2 方法

1.2.1 HSC-T6細(xì)胞總蛋白的提取 取生長(zhǎng)良好的HSC-T6細(xì)胞于25 mL培養(yǎng)瓶里進(jìn)行培養(yǎng)，等到細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的70%左右開始藥物作用，試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)組，空白對(duì)照組（只用培養(yǎng)基培養(yǎng)），而處理組分3組，用NGF作用，低、中、高濃度分別為4、8和16 mg/L。用10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物作用24 h后分別提取細(xì)胞總蛋白，同時(shí)每個(gè)組做3次平行試驗(yàn)。把提取的細(xì)胞總蛋白用3 kD超濾管進(jìn)行超濾脫鹽，然后用考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白質(zhì)濃度，最后把蛋白質(zhì)等量分裝真空凍干機(jī)凍干備用。

1.2.2 雙向凝膠電泳 使用17 cm IPG膠條（非線性）進(jìn)行等電聚焦電泳，應(yīng)用膠內(nèi)泡脹法進(jìn)行加樣，蛋白上樣量為500 μg。采用低電壓50 V，12 h主動(dòng)水化。等電聚焦步驟為：500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 5 h，待17 cm膠條等電聚焦總電壓伏時(shí)達(dá)到60 000 V時(shí)結(jié)束聚焦。將膠條取出，在平衡液中進(jìn)行平衡：第一步使用含有1% DTT的平衡液，15 min；第二步用含4%碘乙酰胺的平衡液，15 min。平衡后將膠條轉(zhuǎn)移到12%的SDS-PAGE上，用0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠后進(jìn)行第二向電泳，電泳條件為每塊膠恒定電流10 mA，30 min后將電流加大到30 mA，待溴酚藍(lán)指示帶到達(dá)凝膠底部處結(jié)束電泳。

1.2.3 銀染 SDS-PAGE凝膠使用固定液固定30 min或者過夜，敏化液敏化30 min，用蒸餾水漂洗3次，每次15 min，然后銀染20 min，倒掉銀染液用蒸餾水漂洗2次，每次1 min，馬上加入顯色液晃動(dòng)直到看到明顯的蛋白點(diǎn)，立刻用終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，并用蒸餾水保存。最后通過GS-800凝膠掃描儀獲得數(shù)字化圖像，然后用PD Quest7.3軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 差異蛋白點(diǎn)分析和質(zhì)譜鑒定 將對(duì)照組和試驗(yàn)組中1.8倍差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切下來，然后進(jìn)行膠內(nèi)酶解，酶解過夜進(jìn)行萃取，并對(duì)萃取液進(jìn)用Zip Tip脫鹽柱除鹽，把所得多肽與基質(zhì)1∶1混合，吸取2 μL混合液點(diǎn)在靶上，讓靶點(diǎn)自然干燥后裝入質(zhì)譜儀，MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)，鑒定出差異蛋白。此步驟由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心蛋白組學(xué)協(xié)助完成。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 將雙向電泳和MALDITOF/TOF-MS篩選出來的的差異蛋白質(zhì)匯總，應(yīng)用UNIPROT數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站和DAVID數(shù)據(jù)分析軟件，按照其生物學(xué)功能及在機(jī)體內(nèi)參與的生理學(xué)反應(yīng)過程將所有的差異蛋白進(jìn)行GO（Gene Ontology）分類（http：//www.geneontology.org/）。對(duì)差異蛋白質(zhì)生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、亞細(xì)胞定位（Cellular Component，CC）、分 子 功 能（Molecular Function，MF）和信號(hào)傳導(dǎo)通路（Pathway）等分析。再結(jié)合聚類分析等找到我們所研究生物系統(tǒng)相對(duì)對(duì)照組在亞細(xì)胞定位、生物通路、分子功能和相互作用網(wǎng)絡(luò)中的變化趨勢(shì)，找到與肝纖維化相關(guān)的生物學(xué)過程等。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析由STATA 7.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件（State Corp，College Station，TX，USA）完成。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE電泳圖

空白對(duì)照組及NGF干預(yù)各組在相同條件下作用24 h后分別提取組細(xì)胞總蛋白，并對(duì)細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用掃描儀進(jìn)行掃描分析，從圖1中可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞總蛋白的條帶清晰，分子量大小不一，NGF干預(yù)個(gè)組與空白對(duì)照組并無明顯的差異。

圖1 細(xì)胞蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 雙向電泳

對(duì)4組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行雙向電泳，利用圖像分析軟件對(duì)蛋白圖譜進(jìn)行分析比較。首先以對(duì)照組建立一個(gè)參考膠進(jìn)行自動(dòng)性的粗略匹配，每一個(gè)個(gè)體膠蛋白點(diǎn)與參考膠進(jìn)行手工匹配和比對(duì)。在對(duì)照組細(xì)胞蛋白雙向電泳圖譜上可觀察到668個(gè)蛋白點(diǎn)，而試驗(yàn)組中的低濃度組可見到647個(gè)蛋白點(diǎn)、中濃度640個(gè)點(diǎn)、高濃度645個(gè)點(diǎn)。以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，3個(gè)試驗(yàn)組圖譜分別與對(duì)照組的匹配率依次為96.8%、95.8%和96.5%，其中在低濃度組中箭頭標(biāo)注并有蛋白質(zhì)ID號(hào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為NGF干預(yù)之后質(zhì)譜鑒定結(jié)果差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，只有箭頭標(biāo)注的為雙向電泳圖譜有差異而在質(zhì)譜鑒定并沒有確定的蛋白質(zhì)點(diǎn)（圖2）。

圖2 雙向電泳圖

2.3 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析

在4組試驗(yàn)中，試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)量相差1.8倍以上的蛋白點(diǎn)共16個(gè)，通過膠內(nèi)原位酶解進(jìn)行PMF的測(cè)定，經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜獲得的13張PMF圖譜，利用PEPTIDEM查詢軟件搜索MASCOT數(shù)據(jù)庫得到13個(gè)蛋白質(zhì)，在NGF作用后的肝星狀細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的蛋白6個(gè)（表1），表達(dá)下調(diào)的蛋白7個(gè)（表2），結(jié)合雙向電泳圖發(fā)現(xiàn)部分蛋質(zhì)點(diǎn)的差異表達(dá)隨著NGF濃度的增加而呈遞增性，部分隨著NGF濃度的增加呈遞減性，這些差異蛋白質(zhì)按其功能可分為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激相關(guān)以及功能尚不清楚的蛋白質(zhì)。

表1 NGF作用肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）后表達(dá)上調(diào)的蛋白

表2 NGF作用肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）后表達(dá)下調(diào)的蛋白

2.4 雙向電泳與質(zhì)譜鑒定出來的差異蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分類分析

2.4.1 GO分類 圖7顯示了質(zhì)譜鑒定出來的蛋白質(zhì)的各種GO分類，包括細(xì)胞功能定位（Cellular Component，CC）、分子功能定位（Molecular Function，MF）、生物學(xué)過程（Biological Process，BP）和信號(hào)通路（Pathway）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白的主要定位以細(xì)胞器為主（圖3-A），分解代謝和酶類蛋白相對(duì)較多（圖3-B），大部分蛋白參與生物發(fā)育、細(xì)胞代謝和生物調(diào)節(jié)等過程（圖3-C）；在信號(hào)通路上，部分蛋白主要參與肥厚型心肌?。℉CM）通路、TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和擴(kuò)張型心肌病通路（圖3-D），其中TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路。

圖3 差異蛋白質(zhì)的GO分類和信號(hào)傳導(dǎo)通路分類

2.4.2 TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路分析 在所鑒定的差異蛋白質(zhì)中一部分是功能已知，有文獻(xiàn)報(bào)道與肝纖維化發(fā)生發(fā)展有明確關(guān)系的蛋白質(zhì)。同時(shí)也有許多功能未知的差異表達(dá)蛋白，這部分蛋白質(zhì)是否與肝纖維化發(fā)展相關(guān)是值得探究的問題，同時(shí)也是我們關(guān)注的重點(diǎn)和進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證和判斷診斷價(jià)值的意義所在。TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展研究最多的一條信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β（transforming growth factor）和轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)HOA（Transforming protein RHOA）在整個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有串聯(lián)其他蛋白相互聯(lián)系的作用，這兩個(gè)蛋白的表達(dá)變化可能參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程（圖4）。

圖4 TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路圖

3 討論

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用已被公認(rèn)，但在肝纖維化領(lǐng)域的研究還知之甚少。近年來，NGF誘導(dǎo)HSC凋亡為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)［2］，HSC是肝纖維化形成過程中合成細(xì)胞外基質(zhì)的最重要細(xì)胞，抑制HSC增殖、誘導(dǎo)其凋亡是抗肝纖維化的關(guān)鍵。研究表明，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性是可行的和具有特異性的肝纖維化治療方法［5］，NGF作為近年來發(fā)現(xiàn)的HSC凋亡誘導(dǎo)劑［6］，已在肝纖維化的研究中引起重視。Trim等［2］將100 mg/L NGF與HSC共同培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)HSC凋亡數(shù)量顯著增加，呈劑量依賴關(guān)系，指出NGF對(duì)體外培養(yǎng)活化的HSC凋亡有誘導(dǎo)作用，其作用機(jī)制可能包括NGF及其低親和力受體p75的作用。本課題組前期研究將最適濃度的蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF（8 mg/L）與HSC-T6共同培養(yǎng)24 h，用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NGF抑制HSC-T6增殖呈時(shí)間依賴性。并且隨著NGF濃度的增加呈劑量依賴性，流式細(xì)胞術(shù)顯示具有誘導(dǎo)其凋亡的作用［4］，這和Trim的結(jié)論相符合。

肝纖維化中沒有基因的異常，而是某些基因過度表達(dá)或表達(dá)不足，對(duì)激活并過度表達(dá)的膠原基因進(jìn)行抑制或封閉，具有廣闊的治療前景［7］。NGF誘導(dǎo)HSC凋亡現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代研究的一個(gè)重要內(nèi)容，蛋白質(zhì)是細(xì)胞、組織乃至生物體發(fā)揮其功能的基本物質(zhì)，因此，在蛋白組水平上研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)的變化對(duì)揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防和治療肝纖維化具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，為在蛋白組學(xué)水平上研究蛋白質(zhì)的表達(dá)提供了科學(xué)而實(shí)用的工具以及思維方式。

本試驗(yàn)用不同濃度的NGF干預(yù)HSC-T6細(xì)胞，通過雙向電泳技術(shù)和時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)在NGF作用24 h后表達(dá)上有了較明顯的變化，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激等過程。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β和轉(zhuǎn)化蛋白 RHOA還參與了TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，并且在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵性的作用。信號(hào)傳導(dǎo)是指細(xì)胞因子通過膜上受體引起細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮細(xì)胞的生理功能的過程，在這個(gè)過程中，不同信號(hào)傳導(dǎo)通路通過各種串話互相影響、制約，共同調(diào)控各種細(xì)胞行為和生理變化過程［8］。肝纖維化發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多細(xì)胞，多因素的復(fù)雜過程，近年來越來越多的證據(jù)表明，信號(hào)傳導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)展過程起著極其重要的作用，并且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常并不是單獨(dú)進(jìn)行的，而是存在于一個(gè)極為復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中，彼此之間相互影響、相互調(diào)控［9］。而在肝纖維化過程中NGF信號(hào)和TGF-β1信號(hào)越來越受到重視，NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，它具有維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的生存、影響中樞神經(jīng)元的生長(zhǎng)、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化、決定軸突生長(zhǎng)等方面的生物學(xué)功能［10，11］。TGF-β1超家族成員眾多，功能廣泛，參與調(diào)控各種細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、分化與凋亡以及胞外基質(zhì)重塑與遷移等，其中大部分作用都是由SMAD蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)通路參與實(shí)現(xiàn)的［12，13］。研究表明，NGF信號(hào)與TGF-β信號(hào)之間具有多種串話機(jī)制，例如，在牙髓細(xì)胞（dental pulp cells）中，TGF-β可以通過MAPK信號(hào)通路來上調(diào)NGF的表達(dá)［14］；而NGF促進(jìn)小神經(jīng)膠質(zhì)遷移的過程受到TGF-β的調(diào)控［15］。肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活［16］?；罨腍SC可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metatloproteinase，MMP）和金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP），但是兩者的分泌量失衡，從而造成I、Ⅲ型膠原為主的ECM成分大量合成和降解不足，進(jìn)而在肝臟中大量沉積，成為肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）是重要的促進(jìn)肝纖維化的細(xì)胞因子，主要通過SMAD蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖和活化，其中SMAD3是TGF-β/SMAD信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)蛋白［17，18］。眾多研究表明，阻斷TGF-β1通路可有力地阻斷肝纖維化［19，20］。但由于TGF-β1 的多功能性，完全阻斷則可能造成嚴(yán)重的副作用［21］，為減小其可能附帶的不良反應(yīng)這一目標(biāo)，選擇恰當(dāng)?shù)闹委煱袠?biāo)成了必須解決的問題。

本試驗(yàn)用眼鏡蛇毒NGF作用HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)下調(diào)，這可能是NGF信號(hào)傳導(dǎo)通路與TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路通過串話機(jī)制發(fā)揮作用，導(dǎo)致TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路通受到抑制。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP-2）也隨之表達(dá)下調(diào)，TIMP-2是抑制ECM合成的一個(gè)重要酶類，其表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致ECM的合成減少而分解加快，從而使肝纖維化的發(fā)展得到緩解甚至逆轉(zhuǎn)。在鑒定出的其他差異蛋白質(zhì)中多數(shù)為酶類，而酶主要參與細(xì)胞的代謝、氧化分解過程，目前雖然沒有太多的研究表明這些酶直接參與肝纖維化。但是從肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程提示我們，這些酶可能影響細(xì)胞的正常代謝，使細(xì)胞的生長(zhǎng)不能有效的維持從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至死亡，這也使得活化的肝纖維化細(xì)胞減少，而減少活化的肝纖維化細(xì)胞恰好是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要途徑，在這些因素的共同作用下達(dá)到抗肝纖維化的目的。

以上試驗(yàn)顯示，眼鏡蛇毒NGF可影響HSC-T6細(xì)胞蛋白的差異表達(dá)，提示NGF可能是通過參與HSC細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路并改變肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抗肝纖維化的目的。由于雙向電泳本身的局限性，使一些等電點(diǎn)和分子量相近的蛋白不能有效的判定其差異表達(dá)，在影響信號(hào)傳導(dǎo)通路過程中應(yīng)該找出更多與信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證，從而更加深入揭示肝纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制及為NGF抗肝纖維化預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

眼鏡蛇毒NGF能改變HSC-T6細(xì)胞信號(hào)通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，其作用的機(jī)理可能是通過上調(diào)或者下調(diào)這些差異蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)抑制HSC-T6細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，為在蛋白質(zhì)水平研究NGF抗肝纖維化機(jī)制提供理論依據(jù)。

［1］ 劉成海, 劉平, 胡義揚(yáng), 朱大元.丹酚酸B鹽對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1刺激肝星狀細(xì)胞活化與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 82（18）：1267-1272.

［2］ Trim N, Morgan S, Evans M, et al. Hepatic stellate cells express the low affinity nerve growth factor receptor P75 and undergo apoptosis in response to nerve growth factor stimulation ［J］. The American Journal Pathology, 2005, 156（4）：1235-1243.

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