NaCl脅迫對小麥種子胚在萌發(fā)時期蛋白含量的影響

劉向標 牛文婷 段江燕

（山西師范大學生命科學學院，臨汾 041000）

土壤鹽漬化影響著人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，生態(tài)環(huán)境也面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和聯(lián)合國教科文組織（UNESCO）對地球土壤進行分析，得出全世界約1.5億hm2的耕地，0.77億hm2受到鹽化的影響［1］。我國的鹽化地約2 000萬hm2，次生鹽化土壤約670萬hm2，約占全國耕地總面積的14%，次生鹽化土壤面積每年以3%的速度擴大［2］。

種子的萌發(fā)是植物生長的最關(guān)鍵時期，在一定的溫度、水分、濕度條件下萌發(fā)時蛋白質(zhì)的變化反映了植物基因組從休止到開啟的表達情況［3］。近年來出現(xiàn)了大量的有關(guān)植物種子萌發(fā)時期蛋白質(zhì)組學研究的文獻報道：Callard等［4］以擬南芥種子為研究對象，分離到1 300多種蛋白質(zhì)。Fu等［5］對擬南芥做了進一步分析，鑒定出355個獨立基因編碼的437個蛋白點。Yang等［6］對水稻種子萌發(fā)進行蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，有63種蛋白下調(diào)，69種蛋白上調(diào)。這些研究中多集中于擬南芥、水稻等植物，而在重要糧食作物小麥中卻少有報道。小麥擁有抗鹽基因［7］，并且有類似的調(diào)節(jié)途徑和抗鹽因子。

2-DE技術(shù)為研究蛋白質(zhì)的動態(tài)變化提供了重要的技術(shù)支撐，可以對生物細胞或組織的蛋白質(zhì)表達進行定量分析，用于揭示不同條件下蛋白質(zhì)表達的變化情況。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高分辨率、重復(fù)性好等優(yōu)點［8］。蛋白質(zhì)組學技術(shù)在植物種子萌發(fā)過程中鑒定出的蛋白質(zhì)，大部分是這一過程中的下游成分，而不是上游成分［9］。同時在所鑒定的相關(guān)蛋白質(zhì)在數(shù)量、種類上還不能組建成詳細的動力學代謝途徑。這些信息的缺乏對我們進一步了解種子萌發(fā)機制是遠遠不足的。因此，我們通過識別NaCl脅迫下小麥種子萌發(fā)的蛋白含量變化的研究，對真正在蛋白質(zhì)水平上進行種子萌發(fā)的研究有重要的意義。

本研究以“晉麥-47”為研究材料，比較不同濃度的NaCl溶液對小麥種子萌發(fā)過程中的抑制作用，確定小麥種子萌發(fā)的NaCl濃度傷害閾值和存活閾值。在小麥萌發(fā)時28 h（胚根突破種皮2-3 mm）時，把胚和胚乳（包含糊粉層）分離，將胚用于2-DE電泳、考馬斯亮藍染色、PDQuest軟件對其進行研究，將有助于我們進一步從時空變化的角度理解NaCl脅迫下對小麥種子萌發(fā)的傷害機制和適應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小麥種子 “晉麥-47”由山西省農(nóng)科院小麥研究所提供。

1.1.2 主要試劑 曲拉通X-100、超純水、蒸餾水、丙酮、過硫酸銨（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N、N-四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋白（BSA）、冰乙酸、甘油、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte）1%溴酚藍、1 mol/L鹽酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、低熔點瓊脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85%磷酸、二硫蘇糖醇（DTT）、95%乙醇、考馬斯亮藍G-250、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）。

1.2 方法

1.2.1 不同NaCl濃度對小麥種子萌發(fā)的影響 選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的種子420粒。（經(jīng)0.1% HgCl2溶液浸沒消毒2 min后再用純水漂洗5次），置于25 mL純水，鋪有雙層定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿60粒蓋上蓋。25℃恒溫避光處理發(fā)芽。在7個培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3和0.4 mol/L濃度的NaCl溶液，實時對培養(yǎng)皿進行稱重補充蒸發(fā)的水分，保證各處理組濃度不變。以28 h胚根突破種皮2-3 mm的種子為標準。在4、8、12、16、20、24和28 h隨機取20粒，統(tǒng)計每組的發(fā)芽率，每組均重復(fù)3次。

1.2.2 取樣 根據(jù)不同NaCl濃度對小麥種子發(fā)芽率的影響，選出有顯著差異的3個NaCl濃度，分別是0、0.1和0.2 mol/L。選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的小麥種子，按照上述方法進行消毒、沖洗、吸去多余的水分后，分別用0、0.1和0.2 mol/L的NaCl溶液中，在25℃恒溫箱中進行避光培養(yǎng)28 h，以胚根突破種皮2 mm為準，進行取樣，將胚和胚乳（包含糊粉層細胞）進行分離。

1.2.3 小麥種子胚中可溶性蛋白2-DE樣品的制備 按照上述3個濃度處理的小麥種子，用尿素/硫脲法提取小麥種子胚蛋白。取出的胚樣品在液氮中磨成粉末加入離心管中，加入尿素/硫脲蛋白提取液振蕩30 s，離心15 min后，取上清液再重復(fù)離心，收集上清液，加入3倍體積冷丙酮，并放入-20℃的冰箱里過夜，次日收集沉淀（視具體情況可再加一次，離心同上），4℃放置，使丙酮充分發(fā)揮，待沉淀干燥后，溶于400 μL樣品裂解液，4℃冰箱中過夜，第2天離心取上清液，得到蛋白質(zhì)樣品液，4℃放置待用。

1.2.4 小麥種子胚中可溶性蛋白濃度的定量測定 把牛血清蛋白母液（100 mg/L）配成不同濃度用分光光度計測其OD值，得出標準曲線。再根據(jù)測得樣品OD值估算出蛋白樣品的濃度，以此確定后續(xù)試驗中加樣量的一致。進行多次重復(fù)試驗，減少試驗的偶然性幾率。

1.2.5 小麥種子胚可溶性蛋白的2-DE 取出已經(jīng)配好的水化上樣液，加入0.001 g DTT，5 μL的40%Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均質(zhì)的水化上樣液與蛋白樣品溶液以4∶1混勻，即為上樣液。采用pH3-10，7 cm線性IPG預(yù)制膠條。主動水化在50 V電壓下12 h后，經(jīng)過250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、4 000 V 3 h、最后穩(wěn)定在4 000 V下進行20 000 Vh，500 V快速保持時間視情況而定。聚焦完畢后，膠條先在平衡液Ⅰ［尿素36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）25 mL、甘油20 mL、DTT 0.2 g］中，在搖床上平衡15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM代替0.2 g DTT，其余組分同平衡Ⅰ）中平衡15 min。然后進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%。

1.2.6 考馬斯亮藍染色 剝離凝膠立即放入固定液（12% TCA）中固定2 h，充分固定后用雙蒸水洗3次，每次5 min，取出放入考馬斯亮藍染液（20%甲醇、1.8%磷酸、8%硫酸銨、0.08%的考馬斯亮藍G250染色至少2 h，脫色液（7%、5%甲醇）脫色1 h后換用雙蒸水進行脫色，直到蛋白點清晰為止。

1.2.7 2-DE圖像分析 凝膠用掃描儀（UMAX）進行掃描，得到蛋白圖像用PDQest軟件進行分析包括背景消減、斑點檢測、匹配、蛋白含量表達分析等。

2 結(jié)果

2.1 NaCl脅迫下小麥種子萌發(fā)的濃度確定

隨著濃度的增大，未萌發(fā)的種子數(shù)目的趨勢增強，選出具有代表不同鹽脅迫下的3個NaCl濃度，即0（對照組）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值），作為鹽脅迫下對小麥種子胚蛋白影響的濃度（圖1）。

由圖1可知，通過不同濃度NaCl處理后小麥萌發(fā)率均下降。濃度越高萌發(fā)率下降的程度越大，對種子的危害程度也越大，這表明NaCl脅迫確實降低了小麥種子的萌發(fā)能力。對不同濃度下NaCl對萌發(fā)率的影響發(fā)現(xiàn)，0 mol/L萌發(fā)率為93%、0.05 mol/L萌發(fā)率為89%，發(fā)現(xiàn)之間的萌發(fā)率差異不明顯，說明0.05 mol/L的NaCl對小麥萌發(fā)的影響并不明顯，可以把0.05 mol/L視作小麥種子萌發(fā)過程中的抗鹽閾值；0.1 mol/L萌發(fā)率為68%、0.15 mol/L萌發(fā)率為60%，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)率差異不明顯，但是與0 mol/L的萌發(fā)率差異顯著，表明這時的濃度已經(jīng)達到或者超過了小麥種子抗傷害的界限，0.1 mol/L可看作是NaCl溶液對小麥種子的傷害閾值；0.2 mol/L萌發(fā)率為27%、0.3 mol/L萌發(fā)率為19%，此時的萌發(fā)率急劇下降，0.2 mol/L可看作是NaCl溶液對小麥種子存活閾值；0.4 mol/L這個濃度萌發(fā)率接近0，可認為0.4 mol/L為致死濃度。根據(jù)不同濃度NaCl脅迫下萌發(fā)情況，選取了有代表性的3個濃度，分別是0（對照組）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值）作為以下研究的NaCl濃度。本研究討論NaCl脅迫下小麥種子萌發(fā)過程中胚蛋白含量的變化，因此致死濃度0.4 mol/L不在本研究的考慮范圍之內(nèi)。

圖 1 不同濃度NaCl對小麥種子萌發(fā)率的影響

2.2 標準曲線繪制

根據(jù)改良Bradford方法測定蛋白質(zhì)含量，并制成標準曲線（圖2）。蛋白質(zhì)上樣量為0.5 mg。由圖2可見，牛血清蛋白的含量與在595 nm的OD值呈線性相關(guān)。

圖2 標準牛血清蛋白曲線

由圖2標準曲線公式可以得出：0.1 mol/L NaCl時 樣 品 的OD值 為0.207，濃 度 為1.096 μg/μL；0 mol/L NaCl時樣品的OD值為0.202，濃度為1.07 μg/μL；0.2 mol/L NaCl時樣品的OD值為0.197，濃度為1.045 μg/μL。

2.3 不同鹽脅迫濃度下提取胚蛋白進行SDS-PAGE所得凝膠膠圖像

為了進一步確定鹽脅迫下影響小麥種子蛋白含量的濃度，分別提取7個濃度下的小麥胚蛋白樣品100 μg進行SDS-PAGE（圖3）。從圖3可以清晰地看到隨著鹽脅迫濃度的上升，在凝膠上出現(xiàn)的蛋白條帶出現(xiàn)的變化，充分說明鹽脅迫確實對小麥胚的蛋白含量產(chǎn)生了影響。

圖3 不同濃度的鹽脅迫對小麥種子胚蛋白的SDS-PAGE

2.4 不同NaCl濃度處理后小麥種子胚差異蛋白變化

選取0、0.1及0.2 mol/L濃度的NaCl處理過的小麥種子露白時期的小麥胚蛋白100 μg，選用10 cm pH3-10的非線性膠條對上述的材料進行雙向電泳。3種濃度的蛋白樣品都進行3次重復(fù)操作。重點檢測變化點，用來了解不同NaCl濃度處理對小麥種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)變化的影響。2-DE上的污點的灰度和位置的變化可以理解為蛋白質(zhì)點的降解、合成或翻譯后修飾。以0 mol/L NaCl處理的種子胚作為參考膠與其他兩塊膠0.1 mol/L NaCl脅迫、0.2 mol/L NaCl脅迫，通過用PDQuest8.0進行比對分析發(fā)現(xiàn)：在檢測到的種子胚中以0 mol/L 時為對照膠約有蛋白點121個（圖4）；0.1 mol/L NaCl脅迫下（圖5）有117個，其中有32個蛋白點豐度下調(diào)，21個蛋白點豐度上調(diào)，其中包括10個表達消失的點，3個新表達的點；在0.2 mol/L NaCl脅迫下（圖6）有102個蛋白點，檢測到46個蛋白質(zhì)點豐度下調(diào)，16個蛋白點的豐度上調(diào)，其中包括16個表達消失的點，7個新表達的點。為了使差異蛋白點更清楚的觀察，對部分變化的蛋白點進行了放大（圖7）。

3 討論

3.1 鹽脅迫條件下NaCl濃度的選擇

圖4 0 mol/L NaCl脅迫下小麥種子2-DE圖譜

圖5 0.1 mol/L NaCl脅迫下小麥種子2-DE圖譜

圖 6 0.2 mol/L NaCl脅迫下小麥種子2-DE圖譜

從不同NaCl濃度對小麥種子萌發(fā)率影響來看，明顯地呈現(xiàn)出隨著濃度的升高未萌發(fā)的種子數(shù)量的趨勢加強。同時，對各濃度下小麥種子蛋白的SDSPAGE上更顯著地體現(xiàn)出圖一相同的特點，即0和0.05 mol/L之間，0.1 mol/L和0.15 mol/L之間，0.2 mol/L和0.3 mol/L之間對種子萌發(fā)的脅迫程度相近。因此，從中選出具有代表不同鹽傷害程度的3個NaCl濃度，即0（CK對照）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值），作為本研究的NaCl處理濃度。因本研究只討論NaCl脅迫下萌發(fā)種子的胚蛋白含量的變化，所以致死濃度0.3 mol/L不在選擇范疇內(nèi)。

圖 7 不同濃度鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)過程中胚蛋白部分放大的差異蛋白點

3.2 雙向電泳分析差異蛋白

植物的整個生命活動周期中，種子的萌發(fā)過程是一個異養(yǎng)過程。對不同濃度處理后的小麥種子，很清楚地發(fā)現(xiàn)鹽脅迫延遲了小麥種子的萌發(fā)。植物在受到非生物脅迫的時候，有些蛋白在萌發(fā)的過程中表達豐度上調(diào)了，這體現(xiàn)了植物體內(nèi)會誘導(dǎo)產(chǎn)生一些新蛋白質(zhì)或原有的蛋白含量的明顯增加以適應(yīng)逆境脅迫。本試驗中NaCl脅迫下處理的小麥種子，其胚蛋白的凝膠圖譜與正常的不同，說明NaCl脅迫處理影響了小麥種子胚中蛋白含量和組分。這與前人的研究結(jié)果一致。在鹽脅迫、臭氧等外界因素的脅迫下，小麥種子中SAM基因的表達增強［10］。大麥、玉米、擬南芥種子中LEA蛋白質(zhì)豐度的降低程度與種子處于寒冷和干旱脅迫有關(guān)［11］，LEA蛋白能夠通過束縛水分子來保護萌發(fā)中的活性組織，進而起到穩(wěn)定蛋白的作用。鹽脅迫下水稻、擬南芥中PSCS基因的轉(zhuǎn)錄水平提高了5倍［12］，說明PSCS基因可被鹽脅迫下誘導(dǎo)表達。山梨醇和海藻糖等也都是細胞滲透調(diào)節(jié)時產(chǎn)生的重要的可溶性物質(zhì)，有利于增強植物的耐鹽性［13］，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等在清除鹽脅迫情況下產(chǎn)生的有害物質(zhì)起到重要作用，同時，在轉(zhuǎn)基因植物中也發(fā)現(xiàn)保護植物組織的相關(guān)蛋白表達含量提高了植物的耐鹽性［14-16］。本研究中通過對不同濃度鹽脅迫下2-DE分析發(fā)現(xiàn)，蛋白含量有下降和上升，也出現(xiàn)一些新蛋白。我們推測，這些變化都是植物體調(diào)節(jié)自身的理化反應(yīng)，從而減緩鹽脅迫情況下給機體帶來的損傷。脅迫影響了胚正常發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的表達，并隨脅迫程度的加強而加大。無規(guī)律變化上調(diào)的蛋白質(zhì)，多是種子萌發(fā)過程中新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，下調(diào)蛋白質(zhì)是成熟種子原來貯藏的蛋白或是原有的mRNA翻譯來的，對上調(diào)點和下調(diào)點影響的不同，說明鹽脅迫的危害主要是由于影響了種子萌發(fā)過程中新蛋白的表達模式。

4 結(jié)論

代表不同鹽傷害程度的3個NaCl處理濃度，即0 mol/L（CK對照）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值）；在該處理濃度下，既有新的蛋白質(zhì)的出現(xiàn)，也有原蛋白子含量的增加和減少。檢測到正常的種子胚有121個點，0.1 mol/L NaCl脅迫下有32個蛋白點豐度下調(diào)，21個蛋白點豐度上調(diào)，其中包括10個表達消失的點，3個新表達的點；在0.2 mol/L NaCl脅迫下，檢測到46個蛋白質(zhì)點豐度下調(diào)，16個蛋白點的豐度上調(diào)，其中包括16個表達消失的點，7個新表達的點。

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