• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    模擬微重力對擬南芥幼苗的生物學效應

    2013-12-23 05:12:02吳承菲郭雙生趙琦孫建鋒
    生物技術(shù)通報 2013年5期
    關鍵詞:植物生長

    吳承菲 郭雙生 趙琦 孫建鋒

    (1.首都師范大學生命科學學院,北京 100048;2.中國航天員科研訓練中心,北京 100094)

    近年來,隨著國際空間站的建成和載人航天技術(shù)的進步,空間生命科學和空間生物技術(shù)領域的研究發(fā)展迅猛。有關微重力,最早是指空間飛行器在軌飛行時,離心力與地球引力相平衡,飛行器艙內(nèi)物體處于接近零重力的狀態(tài),即微重力狀態(tài)[1]。對于微重力下的生物學研究可采用空間搭載和地面模擬方式進行。地面模擬微重力通常采用回轉(zhuǎn)器,主要是當樣品在回轉(zhuǎn)器上時,生物體處于重力場中,受到恒定的重力矢量作用。但是,由于回轉(zhuǎn)器的轉(zhuǎn)動,作用于物體上的重力,方向不斷改變,由于重力方向改變,使生物體來不及感受重力的作用(每種生物都有一個最低感受時間或響應時間閾值),而產(chǎn)生類似于微重力環(huán)境的現(xiàn)象[2]。通過空間飛行及回轉(zhuǎn)器研究表明,微重力會影響植物體的生長和發(fā)育,并會引起植物體生理特性的變化,同時相關基因的差異表達也會發(fā)生改變。20世紀90年代開始,隨著空間搭載機會的增加,空間實驗站的不斷建立,地面模擬實驗的不斷豐富和細胞分子生物學研究技術(shù)的創(chuàng)新,空間細胞生物學研究成果層出不窮。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    擬南芥是野生的雙子葉草本植物,喜濕潤,不耐旱,生長周期短。將少量擬南芥Columbia種子在培養(yǎng)間(22℃,空氣相對濕度≥65%,16 h 光照/8 h 黑暗)進行擴繁,待成熟飽滿后獲取種子并密封,4℃保存。

    1.2 方法

    1.2.1 擬南芥幼苗培養(yǎng) 將擬南芥Columbia種子滅菌15 min后春化2 d,播種于1/2MS培養(yǎng)基上,22℃,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),16 h 光照/8 h 黑暗,處理樣品放置水平回轉(zhuǎn)儀(中科院生物物理所提供)上,2 r/min;對照組(CK) 在實驗臺上培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d 后采收。

    1.2.2 幼苗株高、鮮重的測定 從生長第3天開始,測量處理和對照的擬南芥幼苗的株高、根長、下胚軸長度,直到第8天。在第8天測定幼苗的鮮重。

    1.2.3 葉綠素含量測定 參照Arnon (1949) 的方法。待第8天采收后,用80%丙酮室溫、黑暗條件下提取葉綠素,分別于646 nm 和663 nm 處測定吸光度,根據(jù)Lichtenehaler和Wallbum 的修正公式計算葉綠素a、b、葉綠素(a+b) 的含量及葉綠素a/b的值。

    1.2.4 活性物質(zhì)含量測定 待第8天擬南芥幼苗采收后,充分研磨,分別測定維生素C(Vc) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、過氧化物酶(POD) 、過氧化氫酶(CAT) 的含量(南京建成公司提供的試劑盒)。丙二醛(MDA) 含量的測定采用硫代巴比妥酸(TAB) 法、脯氨酸(pro) 含量的測定采用酸性茚三酮法。

    1.2.5 葉片鈣離子分布的檢測 鈣熒光探針指示劑法是利用與鈣離子結(jié)合探針并發(fā)出熒光的方法來檢測鈣離子的濃度,這種鈣離子指示劑有很高的鈣離子親和能力,能檢測出低濃度的鈣離子。按照文獻[3]采用Fluo-3/AM作為檢測細胞鈣離子濃度的熒光探針。利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察試驗材料。(1)取培養(yǎng)8 d的擬南芥根尖置于100 μL MS液體培養(yǎng)基中;(2)加入1 μL 1 mmol/L Fluo-3/AM,混勻;(3)4℃避光處理2 h,取出后用MS洗2次;(4)室溫下避光放置2 h;(5)激光共聚焦顯微鏡觀察,波長為488 nm,記錄并照相。

    1.2.6 擬南芥幼苗RNA的吸光值的測定

    1.2.6.1 總RNA的提取 擬南芥幼苗RNA 的提取采用Trizol法(Invitrogen 公司提供)。試驗步驟:(1) 稱取100 mg新鮮擬南芥組織加液氮速凍后充分研磨成干粉,轉(zhuǎn)入 1.5 mL離心管中,加入1 mL Trizol,混勻,室溫下靜置3-5 min;(2)每1 mL Trizol加200 mL氯仿,蓋緊管蓋,劇烈振搖15 s,放置5 min;(3)4℃,12 000 r/min離心15 min;(4)RNA存在于上層水相,將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,做好標記;(5)加500 μL異丙醇,-20℃沉淀30 min以上,4℃,12 000 r/min離心10 min;(6)棄去上清,加入1 mL 75%乙醇(用DEPC水配制),洗滌沉淀物,4℃,12 000 r/min離心10 min;(7)吸棄乙醇,空氣中干燥5-10 min;(8)RNA略顯透明,加入30-50 μL RNase-free Water,充分溶解。

    1.2.6.2 總RNA的定量與RNA純度檢測 (l)紫外分光光度計測定RNA的產(chǎn)量:測定RNA溶液的OD260,按照1個OD260=40 μg/mL計算;(2)RNA純度檢測:測定樣品在260 nm和280 nm下的吸光值,OD260/OD280的比值在2.0附近為佳。

    2 結(jié)果

    2.1 模擬微重力對擬南芥幼苗生長發(fā)育的影響

    2.1.1 對幼苗向性的影響 觀察生長8 d的擬南芥幼苗,可以明顯看出,正常重力條件下的擬南芥幼苗莖向上生長,根直立向下生長;而模擬微重力條件下的幼苗生長沒有方向性,莖和根都呈現(xiàn)不定向生長,根呈彎曲狀(圖1),說明模擬微重力影響植物的生長方向。

    圖1 SM條件下(A)和CK條件下(B)擬南芥幼苗圖

    2.1.2 對幼苗株高的影響 分別對幼苗的株高、根長、下胚軸長度進行了測定,模擬微重力下生長8 d 的幼苗株高比對照低,在3-5 d 時,處理的幼苗的株高、根長比對照長,而5 d之后,處理的株高和根長都比對照短;而且,下胚軸長度比對照長約0.804 mm(表1),說明模擬微重力影響植物的生長。

    2.2 模擬微重力對擬南芥幼苗生理特性的影響

    2.2.1 對幼苗光合特性的影響 光合作用中葉綠體對光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化主要是通過葉綠素a 和葉綠素b完成的。分別測定了生長8 d的處理和對照的幼苗的葉綠素含量,處理的幼苗的葉綠素a和葉綠素b的含量均高于對照組,但葉綠素a/b的比值有所下降。光合速率測定結(jié)果表明,對照與處理的光合速率無顯著差異,說明微重力環(huán)境會提高擬南芥的葉綠素含量,而對光合作用效率無顯著影響。

    2.2.2 模擬微重力對幼苗活性物質(zhì)含量的影響 用試劑盒和紫外分光光度計分別測定維生素C(Vc) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、過氧化物酶(POD) 、過氧化氫酶(CAT) 的含量。處理的Vc含量減少,而POD、SOD和CAT含量卻高于對照。而且,通過對丙二醛(MDA)和脯氨酸(pro)含量的測定發(fā)現(xiàn),處理的丙二醛與脯氨酸含量明顯高于對照。

    表1 模擬微重力(SM)與正常重力(CK)條件下擬南芥生理生化指標測定數(shù)據(jù)

    2.3 模擬微重力影響幼苗葉片的鈣離子分布

    Fluo-3熒光染料與游離鈣離子結(jié)合可發(fā)出綠色熒光,在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),處理的擬南芥葉片細胞壁的綠色熒光十分明顯,如圖2所示。

    圖2 正常重力條件下(A)與模擬微重力條件下(B)擬南芥葉肉細胞鈣離子分布

    2.4 模擬微重力對基因表達的影響

    生物體在重力改變的情況下,生長代謝、遺傳發(fā)育、生理特性及顯微結(jié)構(gòu)的變化都是由基因調(diào)控的。本實驗室在R平臺上用ANOVA的方法挑選出模擬微重力處理6 d的差異基因和模擬微重力處理1 d的差異基因?;蛐酒Y(jié)果表明,模擬微重力處理6 d后的擬南芥差異表達的基因有450個,上調(diào)表達201個,下調(diào)表達249個,上調(diào)倍數(shù)最大為4.25,下調(diào)倍數(shù)最小為0.37;在模擬微重力處理1 d后擬南芥差異表達的基因有365個,上調(diào)表達136個,下調(diào)表達229個,上調(diào)倍數(shù)最大為2.19,下調(diào)倍數(shù)最小為0.43。

    3 討論

    室外培養(yǎng)的擬南芥種子一般春季萌發(fā),到夏季即種子成熟,因此,生殖生長延緩,生活周期過長,不利于加快實驗進程。而室內(nèi)培養(yǎng)是將種子播撒于營養(yǎng)土、蛭石、素沙按體積比1∶1∶1均勻混合的培養(yǎng)介質(zhì)中,該方法使用的培養(yǎng)介質(zhì)既有擬南芥苗期根系生長所需的透水和透氣性,又能為擬南芥后期生長提供養(yǎng)分,且水、肥和氣均供應均衡一致,且室內(nèi)培養(yǎng)的成活率較高,生長健壯,生長發(fā)育進程快且整齊,因此能最好的發(fā)揮擬南芥?zhèn)€體小和生育期短的優(yōu)勢,降低生物實驗系統(tǒng)誤差。

    許多文獻提出,微重力環(huán)境對于正常生長的植物來說是一個逆境條件,改變重力的大小和方向都會影響植物的代謝、生長、發(fā)育、繁殖及應激反應等[5,6]。植物在正常的重力下,根向下生長,莖向上生長。在微重力環(huán)境下,根的生長方向依種胚所處的方位而定。地上部生長取決于光源的位置,在微重力場中向光性彎曲更加明顯,因此,莖和根都呈現(xiàn)不定向生長,根呈彎曲狀。目前,已有多項研究表明模擬微重力會影響植物的細胞形態(tài)和植物細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)[7]。有人報道,太空飛行的豌豆幼苗根細胞變長,表面積變大,而細胞核變小。有研究者[8]采用馬鈴薯、香石竹、草莓及人參果的試管幼苗作為試驗材料,分別置于正常重力環(huán)境中和模擬微重力環(huán)境中,待生長8 d后,對4種植物的電鏡切片觀察發(fā)現(xiàn),模擬微重力對植物細胞亞顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響:細胞壁收縮呈不規(guī)則多角形,細胞之間聯(lián)結(jié)松散,而且葉綠體片層結(jié)構(gòu)明顯彎曲、疏松和膨化,并且變得模糊。線粒體表面的膜粗糙、嵴不明顯、結(jié)構(gòu)松散。Popova等[9]觀察了飛行10.5 d 和18 d 的小球藻細胞發(fā)現(xiàn)細胞分裂受到干擾,類囊體腔膨脹,葉綠體出現(xiàn)電子半透明區(qū)。同時,類囊體相對體積減小。黃偉等[8]觀察玉米在微重力下會導致細胞出現(xiàn)畸形核,這可能與細胞骨架遭到破壞有關。POD、SOD和CAT是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的3種重要保護酶,它們能夠有效阻止活性氧在植物體內(nèi)的積累。因此,POD、SOD和CAT活性的升高反映出植物在逆境下,能通過自身防御機制對有害物質(zhì)做出保護性應激反應[10-12]。我們的試驗結(jié)果表明,模擬微重力處理后3種抗氧化酶活性均有不同程度的提高,表明擬南芥幼苗對微重力刺激作出了保護性應激反應。而Vc是植物體內(nèi)抗氧化的成分,體內(nèi)活性氧的增加會導致Vc的含量發(fā)生變化,Vc的抗氧化功能同樣可以防止活性氧對植物組織的破壞。在防御應激過程中,植物體消耗了大量的Vc,因此,Vc含量的下降同樣也說明擬南芥幼苗對微重力刺激作出了保護性應激反應。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一,具有細胞毒性,能引起細胞膜功能紊亂[13]。模擬微重力處理后,擬南芥體內(nèi)活性氧含量增加,導致MDA的升高,說明模擬微重力類似于逆境刺激。因此,造成MDA升高。鈣離子是真核生物中調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導的第二信使,鈣離子參與植物應激、抗逆、抗病等一系列刺激反應的調(diào)節(jié)[14,15]。有人研究了模擬微重力條件下的草莓和香石竹的株高、葉片數(shù)、葉綠素含量及光合速率發(fā)現(xiàn),微重力對葉綠體的正常光合功能沒有顯著影響。此外,有研究者發(fā)現(xiàn),重力改變時,擬南芥的鈣離子分布和濃度也發(fā)生改變,進而引起一系列的生物效應[15]。徐偉等[16]對微重力條件下蘆筍根尖鈣離子的分布的研究發(fā)現(xiàn),微重力條件下根尖細胞鈣離子濃度比對照的鈣離子濃度低。本試驗結(jié)果顯示,模擬微重力環(huán)境下,擬南芥葉片的鈣離子濃度比對照的鈣離子濃度高,說明模擬微重力影響鈣離子的分布。這些結(jié)果表明鈣離子在植物的微重力效應過程中起到很大的作用。但是,根和葉片在模擬微重力條件下的鈣離子分布狀況有所不同,很可能是由于重力方向發(fā)生改變,鈣離子在植物組織細胞中進行移動,如果集中移動到根部,葉片中就減少了鈣離子,如果集中移動到根部,葉片就減少了鈣離子。結(jié)果顯示,模擬微重力,促使鈣離子移動到了葉片細胞中,徐偉等僅對玉米根尖鈣離子分布進行了觀察,未對葉片鈣離子分布進行檢測,所以,本試驗的結(jié)果和前人并不矛盾。Mari 等[17]以水蕨屬作為試驗材料,對其孢子進行了不同時間(包括1、8和20 h)的模擬微重力處理,提取RNA并進行實時定量RT-PCR,然后比較分析芯片結(jié)果,通過基因表達分析發(fā)現(xiàn),1 h處理的孢子的2 110個基因中有3.46%基因位點發(fā)生改變,其中37個基因明顯上調(diào),25個基因下調(diào)表達;8 h 處理的孢子的2 486個基因中有5.91%發(fā)生改變,其中70個明顯上調(diào)表達,42個下調(diào)表達;經(jīng)20 h處理的孢子的2 797個基因中有5.20%發(fā)生改變,其中有53個上調(diào)表達,48個下調(diào)表達[18]。對人腎細胞進行空間搭載后發(fā)現(xiàn),有1 632個基因表達發(fā)生了明顯改變[19]。Barjaktarovi?等[20]對7 g處理1 h的擬南芥愈傷組織進行了基因芯片分析發(fā)現(xiàn),200多個基因表達明顯上調(diào),他們還通過蛋白質(zhì)組學的方法發(fā)現(xiàn),超重1 h處理的愈傷組織中有28個蛋白發(fā)生了明顯改變。

    4 結(jié)論

    本研究有關基因芯片分析結(jié)果或許可以說明,上述這些生理指標差異,很可能與模擬微重力處理的差異表達有關,處理6 d上調(diào)表達201個,下調(diào)表達249個;處理1 d 差異表達的基因,上調(diào)表達136個,下調(diào)表達229個,或許這些差異表達的基因是由微重力處理引起的,研究結(jié)果尚需進一步驗證。

    [1] 王浩, 牛顏冰.航天育種機理的研究進展[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版, 2009, 29(2):120-121.

    [2] Albrecht-Buehler G. The simulation of microgravity conditions on the ground[J]. ASGSB Bulletin, 1992, 5(2):3-10.

    [3] Sobol M, Kordyum E. Distribution of calcium ions in cells of the root distal elongation zone under clinorotation[J]. Microgravity Sci Technol, 2009, 21(1-2):179-185.

    [4] Zhao Q, Li J, Liu M. Effects of simulated microgravity on characteristics of photosynthesis in plant seedling[J]. Space Medicine & Medical Engineering, 2002, 15(2):79-83.

    [5] 鄭景生.微重力下的植物生物學效應與空間誘變育種研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版, 2003, 25(5) :671-675.

    [6] 費翅鯤, 胡向陽, 崔大勇, 等.模擬微重力的植物生物學效應[J]. 自然科學進展, 2002, 12(2) :135-139.

    [7] 劉敏, 王亞林, 薛淮, 等.模擬微重力條件下植物細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的研究[J]. 航天醫(yī)學與醫(yī)學工程, 1999, 12(5):360-363.

    [8] 黃偉, 黃曉兵, 郭梅, 等.模擬微重力對玉米根尖細胞核的影響[J].內(nèi)江師范學院學報, 2008, 23(4):57-59.

    [9] Hilaire E, Guikema JA, Brown J, Gravit CS. Clinorotation affects soybean seedling morphology[J]. Physiology, 1995, 2:149-150.

    [10] Kochba J, Lvee S. Differences is peroxidase activity and isoenzymes in embryogenic and non-embryogenic shamouti orange ovular callus lines[J]. Plant Cell Physiology, 1977, 18:463-467.

    [11] Cai WM. Isozyme analysis of SOD of several plants species in simulate microgravity condition[J]. Acta Phytophysiologica Sinica, 2000, 26:137-142.

    [12] Hepler PK, Wayne RO. Calcium and plant development[J]. Annu Rev Plant Physiol, 1985, 36:397-439.

    [13] Zhao HC, Zhu T, Wu J, Xi BS. Effect of simulated microgravity on aged pea seed vigour and related physiological properties[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2003, 27:311-314.

    [14] Gilroy S, Jones RL. Gibberellic acid and abscisic acid coordinately regulate cytoplasmic calcium and secretory activity in barley aleurone protoplasts[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(8):3591-3995.

    [15] Hilaire E, Paulsen AO, Brown CS, et al. Microgravity and clinorotation cause redistribution of free calcium in sweet clover columella cells[J]. Plant Cell Physiol, 1995, 36:831-837.

    [16] 徐繼, 趙琦. 微重力對石刁柏根尖組織和細胞中鈣水平及分布的影響[J]. 生物物理學報, 1999, 15(2):381-386.

    [17] Salmi ML, Roux SJ. Gene expression changes induced by space flight in single-cells of the fern Ceratopteris richardii[J]. Planta, 2008, 229:151-159.

    [18] Centis-Aubay S, Gasset G, Mazars C, et al. Changes in gravitational forces induce modifications of gene expression in A. thaliana seedlings[J]. Planta, 2003, 218:179-185.

    [19] Commission on Physical Sciences Mathematics and Applications National Research Council. Biological sciences and biotechnology microgravity research opportunities for the 1990s[R]. Conmittee on Microgravity Research Space Studies Board, 1999:62-75.

    [20] Barjaktarovi? ?, Babbick M, Nordheim A, et al. Alterations in protein expression of Arabidopsis thaliana cell cultures during hyper- and simulated micro-gravity[J]. Microgravity Sci Technol, 2009, 21:191-196.

    猜你喜歡
    植物生長
    碗蓮生長記
    小讀者(2021年2期)2021-03-29 05:03:48
    共享出行不再“野蠻生長”
    生長在哪里的啟示
    華人時刊(2019年13期)2019-11-17 14:59:54
    野蠻生長
    NBA特刊(2018年21期)2018-11-24 02:48:04
    生長
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:14
    植物的防身術(shù)
    把植物做成藥
    哦,不怕,不怕
    將植物穿身上
    《生長在春天》
    亚洲精品一区蜜桃| 26uuu在线亚洲综合色| 国产不卡av网站在线观看| 一本大道久久a久久精品| 国产国语露脸激情在线看| 黄色一级大片看看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 久久久久久久大尺度免费视频| xxxhd国产人妻xxx| 日本色播在线视频| 亚洲久久久国产精品| 久久久久久久久久久丰满| 免费观看性生交大片5| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久精品国产亚洲av天美| av国产精品久久久久影院| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 少妇的逼水好多| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| av免费在线看不卡| 在线看a的网站| 秋霞伦理黄片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黄片播放在线免费| 最新中文字幕久久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av在线老鸭窝| 午夜激情av网站| 亚洲情色 制服丝袜| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 在线观看免费日韩欧美大片 | 9色porny在线观看| 美女主播在线视频| 国产在线免费精品| 久久精品国产a三级三级三级| 精品久久久精品久久久| 精品久久蜜臀av无| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久毛片免费看一区二区三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 国产精品一区www在线观看| 9色porny在线观看| 人人妻人人澡人人看| 大话2 男鬼变身卡| 精品人妻在线不人妻| 亚洲成人一二三区av| 99九九在线精品视频| 亚洲内射少妇av| 久久99精品国语久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美bdsm另类| 免费观看av网站的网址| 国产毛片在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 99久久综合免费| 亚洲国产欧美在线一区| 2022亚洲国产成人精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 高清在线视频一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 一级毛片 在线播放| 视频在线观看一区二区三区| 大香蕉久久网| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品第二区| 久久 成人 亚洲| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久国产网址| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品一区二区在线不卡| 日韩制服骚丝袜av| 一级,二级,三级黄色视频| 国产成人精品福利久久| 国产色婷婷99| 蜜桃国产av成人99| 老司机亚洲免费影院| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品人妻久久久影院| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲国产最新在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 大片免费播放器 马上看| 搡老乐熟女国产| 在线观看三级黄色| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品,欧美精品| 国产成人精品无人区| 波野结衣二区三区在线| 麻豆成人av视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 啦啦啦啦在线视频资源| 水蜜桃什么品种好| 99久久精品国产国产毛片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 精品一区二区免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产精品一区二区在线观看99| 欧美+日韩+精品| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲四区av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产成人一区二区在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美少妇被猛烈插入视频| 2022亚洲国产成人精品| 久久热精品热| 精品熟女少妇av免费看| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美精品亚洲一区二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 只有这里有精品99| 国产成人一区二区在线| 久久久久久久久久久丰满| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩av免费高清视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 老司机影院毛片| 欧美丝袜亚洲另类| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲av日韩在线播放| 人妻一区二区av| 国产亚洲精品久久久com| 国产片内射在线| 2022亚洲国产成人精品| 国产欧美亚洲国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费黄色在线免费观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 如何舔出高潮| 一级片'在线观看视频| 18在线观看网站| 久久国产精品大桥未久av| 两个人免费观看高清视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费观看的影片在线观看| 久久ye,这里只有精品| 精品一区二区免费观看| 大香蕉久久网| 日韩电影二区| 在线观看一区二区三区激情| 少妇熟女欧美另类| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 国模一区二区三区四区视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 中文天堂在线官网| 亚洲无线观看免费| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 男的添女的下面高潮视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲内射少妇av| 美女主播在线视频| 全区人妻精品视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品第二区| 最近手机中文字幕大全| 欧美国产精品一级二级三级| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久精品免费免费高清| 自线自在国产av| 女性被躁到高潮视频| 91久久精品国产一区二区成人| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 色5月婷婷丁香| 丁香六月天网| 亚洲不卡免费看| a级毛色黄片| 国产精品嫩草影院av在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 大码成人一级视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中文天堂在线官网| 亚洲成人av在线免费| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 各种免费的搞黄视频| 免费观看在线日韩| 成人免费观看视频高清| 午夜免费男女啪啪视频观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美亚洲日本最大视频资源| av不卡在线播放| 嫩草影院入口| 天堂8中文在线网| 2018国产大陆天天弄谢| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲av成人精品一区久久| 精品人妻熟女av久视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产毛片在线视频| 99久久精品一区二区三区| 丁香六月天网| 99久久人妻综合| 午夜影院在线不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 韩国av在线不卡| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜激情久久久久久久| 99热国产这里只有精品6| 最新的欧美精品一区二区| 三级国产精品欧美在线观看| 色94色欧美一区二区| 免费看光身美女| 免费看不卡的av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 日韩大片免费观看网站| 日韩中字成人| 一区二区三区精品91| 美女大奶头黄色视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 看十八女毛片水多多多| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩伦理黄色片| 日本av免费视频播放| 国产黄色免费在线视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 熟女电影av网| 大香蕉久久网| 麻豆成人av视频| 蜜桃在线观看..| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 中国国产av一级| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 99国产精品免费福利视频| 人妻一区二区av| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲性久久影院| av黄色大香蕉| 国产在线一区二区三区精| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲成人一二三区av| 亚洲成人一二三区av| 另类精品久久| 国产一级毛片在线| 飞空精品影院首页| 天堂俺去俺来也www色官网| 97精品久久久久久久久久精品| 丝袜脚勾引网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久精品夜色国产| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲四区av| 观看美女的网站| av在线播放精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 高清欧美精品videossex| 蜜桃国产av成人99| 精品久久久噜噜| 男人添女人高潮全过程视频| 精品久久久噜噜| 午夜免费观看性视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品久久久久久精品古装| 999精品在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 夜夜爽夜夜爽视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av专区在线播放| 国产成人一区二区在线| 国产精品不卡视频一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 久久av网站| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲经典国产精华液单| .国产精品久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人精品久久久久久| 国产成人精品无人区| 国产成人freesex在线| 亚洲国产日韩一区二区| 免费av不卡在线播放| 欧美三级亚洲精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 美女大奶头黄色视频| 高清午夜精品一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品日韩在线中文字幕| av在线观看视频网站免费| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美精品一区二区大全| 这个男人来自地球电影免费观看 | 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人freesex在线| 岛国毛片在线播放| 国产av码专区亚洲av| 免费观看在线日韩| 人成视频在线观看免费观看| 天天操日日干夜夜撸| 伊人亚洲综合成人网| 只有这里有精品99| av播播在线观看一区| 久久99精品国语久久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 在线观看人妻少妇| 国产高清三级在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲国产日韩一区二区| 精品酒店卫生间| av.在线天堂| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲精品,欧美精品| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久久久伊人网av| 十分钟在线观看高清视频www| 久久久国产一区二区| 天堂8中文在线网| 久久午夜福利片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 99热6这里只有精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 美女中出高潮动态图| 国产伦理片在线播放av一区| av有码第一页| 边亲边吃奶的免费视频| 熟女电影av网| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 多毛熟女@视频| 国产av国产精品国产| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美日韩av久久| 成人二区视频| 少妇精品久久久久久久| 国产不卡av网站在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产男女内射视频| 久久综合国产亚洲精品| videossex国产| 少妇 在线观看| 老熟女久久久| 少妇的逼水好多| 免费高清在线观看日韩| 大话2 男鬼变身卡| 日本与韩国留学比较| 七月丁香在线播放| 人人澡人人妻人| 亚洲国产最新在线播放| 午夜激情福利司机影院| 久久精品夜色国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩成人伦理影院| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 一级毛片电影观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久精品国产a三级三级三级| 精品视频人人做人人爽| 波野结衣二区三区在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产男女内射视频| 日韩亚洲欧美综合| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 亚洲第一av免费看| 美女大奶头黄色视频| 国产精品欧美亚洲77777| 99九九在线精品视频| 亚洲五月色婷婷综合| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 热99久久久久精品小说推荐| av.在线天堂| 五月伊人婷婷丁香| 一边亲一边摸免费视频| 91精品国产国语对白视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 在线精品无人区一区二区三| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美日韩视频精品一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久97久久精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人精品在线电影| 最新中文字幕久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一级毛片 在线播放| 免费大片18禁| 国产视频内射| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品av久久久久免费| 9191精品国产免费久久| 男男h啪啪无遮挡| 激情在线观看视频在线高清 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲国产欧美一区二区综合| 黑人猛操日本美女一级片| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美日韩精品网址| www.自偷自拍.com| 91精品三级在线观看| 久久99一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 久久 成人 亚洲| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品一区二区三卡| av在线播放免费不卡| 精品国产乱码久久久久久男人| 99香蕉大伊视频| 2018国产大陆天天弄谢| 成人永久免费在线观看视频 | 国产一区二区三区视频了| 久久毛片免费看一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 一级毛片女人18水好多| 搡老岳熟女国产| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲三区欧美一区| 久久久久精品人妻al黑| 午夜老司机福利片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 人妻 亚洲 视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 大码成人一级视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产区一区二久久| 两个人看的免费小视频| 五月天丁香电影| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产在线视频一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 少妇 在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品免费久久久久久久清纯 | 天堂8中文在线网| av不卡在线播放| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一进一出好大好爽视频| 日韩视频一区二区在线观看| 成人手机av| 国产成人啪精品午夜网站| 大片免费播放器 马上看| 麻豆乱淫一区二区| 午夜福利视频在线观看免费| www.999成人在线观看| 69av精品久久久久久 | 久久久久国产一级毛片高清牌| xxxhd国产人妻xxx| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 999久久久国产精品视频| 亚洲第一av免费看| 黄色视频,在线免费观看| 制服诱惑二区| 中文字幕最新亚洲高清| 高清欧美精品videossex| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产xxxxx性猛交| 国产免费现黄频在线看| 国产成人影院久久av| 久久久国产一区二区| 香蕉久久夜色| 91字幕亚洲| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲av欧美aⅴ国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 怎么达到女性高潮| 亚洲熟女毛片儿| 久久久精品免费免费高清| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| bbb黄色大片| 日日夜夜操网爽| 久久婷婷成人综合色麻豆| 蜜桃在线观看..| 中文亚洲av片在线观看爽 | 757午夜福利合集在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久亚洲精品不卡| 国产有黄有色有爽视频| 热99re8久久精品国产| www.熟女人妻精品国产| 在线观看免费高清a一片| 飞空精品影院首页| 亚洲久久久国产精品| 十八禁人妻一区二区| 黑人猛操日本美女一级片| 手机成人av网站| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人影院久久av| 大片电影免费在线观看免费| 丰满少妇做爰视频| 日韩一区二区三区影片| 国产野战对白在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲黑人精品在线| 亚洲人成电影观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人妻 亚洲 视频| 女人精品久久久久毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 91成人精品电影| 久久性视频一级片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| √禁漫天堂资源中文www| 自线自在国产av| 91国产中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 色94色欧美一区二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 搡老岳熟女国产| 三级毛片av免费| 亚洲精品在线美女| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久99热这里只频精品6学生| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品国产乱码久久久久久小说| 老司机靠b影院| 男女边摸边吃奶| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 亚洲美女黄片视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 男女边摸边吃奶| 不卡av一区二区三区| 露出奶头的视频| 看免费av毛片| kizo精华| 欧美中文综合在线视频| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇 在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 中文字幕最新亚洲高清| 成年动漫av网址| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲国产成人一精品久久久| a在线观看视频网站| 在线 av 中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 脱女人内裤的视频| 免费在线观看完整版高清| 国产精品欧美亚洲77777| 天天影视国产精品| 亚洲免费av在线视频| 韩国精品一区二区三区| 久久性视频一级片| 欧美成人午夜精品|