模擬微重力對擬南芥幼苗的生物學效應

吳承菲 郭雙生 趙琦 孫建鋒

（1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048；2.中國航天員科研訓練中心，北京 100094）

近年來，隨著國際空間站的建成和載人航天技術的進步，空間生命科學和空間生物技術領域的研究發(fā)展迅猛。有關微重力，最早是指空間飛行器在軌飛行時，離心力與地球引力相平衡，飛行器艙內(nèi)物體處于接近零重力的狀態(tài)，即微重力狀態(tài)［1］。對于微重力下的生物學研究可采用空間搭載和地面模擬方式進行。地面模擬微重力通常采用回轉(zhuǎn)器，主要是當樣品在回轉(zhuǎn)器上時，生物體處于重力場中，受到恒定的重力矢量作用。但是，由于回轉(zhuǎn)器的轉(zhuǎn)動，作用于物體上的重力，方向不斷改變，由于重力方向改變，使生物體來不及感受重力的作用（每種生物都有一個最低感受時間或響應時間閾值），而產(chǎn)生類似于微重力環(huán)境的現(xiàn)象［2］。通過空間飛行及回轉(zhuǎn)器研究表明，微重力會影響植物體的生長和發(fā)育，并會引起植物體生理特性的變化，同時相關基因的差異表達也會發(fā)生改變。20世紀90年代開始，隨著空間搭載機會的增加，空間實驗站的不斷建立，地面模擬實驗的不斷豐富和細胞分子生物學研究技術的創(chuàng)新，空間細胞生物學研究成果層出不窮。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥是野生的雙子葉草本植物，喜濕潤，不耐旱，生長周期短。將少量擬南芥Columbia種子在培養(yǎng)間（22℃，空氣相對濕度≥65%，16 h 光照/8 h 黑暗）進行擴繁，待成熟飽滿后獲取種子并密封，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥幼苗培養(yǎng) 將擬南芥Columbia種子滅菌15 min后春化2 d，播種于1/2MS培養(yǎng)基上，22℃，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h 光照/8 h 黑暗，處理樣品放置水平回轉(zhuǎn)儀（中科院生物物理所提供）上，2 r/min；對照組（CK） 在實驗臺上培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d 后采收。

1.2.2 幼苗株高、鮮重的測定 從生長第3天開始，測量處理和對照的擬南芥幼苗的株高、根長、下胚軸長度，直到第8天。在第8天測定幼苗的鮮重。

1.2.3 葉綠素含量測定 參照Arnon （1949） 的方法。待第8天采收后，用80%丙酮室溫、黑暗條件下提取葉綠素，分別于646 nm 和663 nm 處測定吸光度，根據(jù)Lichtenehaler和Wallbum 的修正公式計算葉綠素a、b、葉綠素（a+b） 的含量及葉綠素a/b的值。

1.2.4 活性物質(zhì)含量測定 待第8天擬南芥幼苗采收后，充分研磨，分別測定維生素C（Vc） 、超氧化物歧化酶（SOD） 、過氧化物酶（POD） 、過氧化氫酶（CAT） 的含量（南京建成公司提供的試劑盒）。丙二醛（MDA） 含量的測定采用硫代巴比妥酸（TAB） 法、脯氨酸（pro） 含量的測定采用酸性茚三酮法。

1.2.5 葉片鈣離子分布的檢測 鈣熒光探針指示劑法是利用與鈣離子結合探針并發(fā)出熒光的方法來檢測鈣離子的濃度，這種鈣離子指示劑有很高的鈣離子親和能力，能檢測出低濃度的鈣離子。按照文獻［3］采用Fluo-3/AM作為檢測細胞鈣離子濃度的熒光探針。利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察試驗材料。（1）取培養(yǎng)8 d的擬南芥根尖置于100 μL MS液體培養(yǎng)基中；（2）加入1 μL 1 mmol/L Fluo-3/AM，混勻；（3）4℃避光處理2 h，取出后用MS洗2次；（4）室溫下避光放置2 h；（5）激光共聚焦顯微鏡觀察，波長為488 nm，記錄并照相。

1.2.6 擬南芥幼苗RNA的吸光值的測定

1.2.6.1 總RNA的提取 擬南芥幼苗RNA 的提取采用Trizol法（Invitrogen 公司提供）。試驗步驟：（1） 稱取100 mg新鮮擬南芥組織加液氮速凍后充分研磨成干粉，轉(zhuǎn)入 1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，混勻，室溫下靜置3-5 min；（2）每1 mL Trizol加200 mL氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振搖15 s，放置5 min；（3）4℃，12 000 r/min離心15 min；（4）RNA存在于上層水相，將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，做好標記；（5）加500 μL異丙醇，-20℃沉淀30 min以上，4℃，12 000 r/min離心10 min；（6）棄去上清，加入1 mL 75%乙醇（用DEPC水配制），洗滌沉淀物，4℃，12 000 r/min離心10 min；（7）吸棄乙醇，空氣中干燥5-10 min；（8）RNA略顯透明，加入30-50 μL RNase-free Water，充分溶解。

1.2.6.2 總RNA的定量與RNA純度檢測 （l）紫外分光光度計測定RNA的產(chǎn)量：測定RNA溶液的OD260，按照1個OD260=40 μg/mL計算；（2）RNA純度檢測：測定樣品在260 nm和280 nm下的吸光值，OD260/OD280的比值在2.0附近為佳。

2 結果

2.1 模擬微重力對擬南芥幼苗生長發(fā)育的影響

2.1.1 對幼苗向性的影響 觀察生長8 d的擬南芥幼苗，可以明顯看出，正常重力條件下的擬南芥幼苗莖向上生長，根直立向下生長；而模擬微重力條件下的幼苗生長沒有方向性，莖和根都呈現(xiàn)不定向生長，根呈彎曲狀（圖1），說明模擬微重力影響植物的生長方向。

圖1 SM條件下（A）和CK條件下（B）擬南芥幼苗圖

2.1.2 對幼苗株高的影響 分別對幼苗的株高、根長、下胚軸長度進行了測定，模擬微重力下生長8 d 的幼苗株高比對照低，在3-5 d 時，處理的幼苗的株高、根長比對照長，而5 d之后，處理的株高和根長都比對照短；而且，下胚軸長度比對照長約0.804 mm（表1），說明模擬微重力影響植物的生長。

2.2 模擬微重力對擬南芥幼苗生理特性的影響

2.2.1 對幼苗光合特性的影響 光合作用中葉綠體對光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化主要是通過葉綠素a 和葉綠素b完成的。分別測定了生長8 d的處理和對照的幼苗的葉綠素含量，處理的幼苗的葉綠素a和葉綠素b的含量均高于對照組，但葉綠素a/b的比值有所下降。光合速率測定結果表明，對照與處理的光合速率無顯著差異，說明微重力環(huán)境會提高擬南芥的葉綠素含量，而對光合作用效率無顯著影響。

2.2.2 模擬微重力對幼苗活性物質(zhì)含量的影響 用試劑盒和紫外分光光度計分別測定維生素C（Vc） 、超氧化物歧化酶（SOD） 、過氧化物酶（POD） 、過氧化氫酶（CAT） 的含量。處理的Vc含量減少，而POD、SOD和CAT含量卻高于對照。而且，通過對丙二醛（MDA）和脯氨酸（pro）含量的測定發(fā)現(xiàn)，處理的丙二醛與脯氨酸含量明顯高于對照。

表1 模擬微重力（SM）與正常重力（CK）條件下擬南芥生理生化指標測定數(shù)據(jù)

2.3 模擬微重力影響幼苗葉片的鈣離子分布

Fluo-3熒光染料與游離鈣離子結合可發(fā)出綠色熒光，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，處理的擬南芥葉片細胞壁的綠色熒光十分明顯，如圖2所示。

圖2 正常重力條件下（A）與模擬微重力條件下（B）擬南芥葉肉細胞鈣離子分布

2.4 模擬微重力對基因表達的影響

生物體在重力改變的情況下，生長代謝、遺傳發(fā)育、生理特性及顯微結構的變化都是由基因調(diào)控的。本實驗室在R平臺上用ANOVA的方法挑選出模擬微重力處理6 d的差異基因和模擬微重力處理1 d的差異基因?；蛐酒Y果表明，模擬微重力處理6 d后的擬南芥差異表達的基因有450個，上調(diào)表達201個，下調(diào)表達249個，上調(diào)倍數(shù)最大為4.25，下調(diào)倍數(shù)最小為0.37；在模擬微重力處理1 d后擬南芥差異表達的基因有365個，上調(diào)表達136個，下調(diào)表達229個，上調(diào)倍數(shù)最大為2.19，下調(diào)倍數(shù)最小為0.43。

3 討論

室外培養(yǎng)的擬南芥種子一般春季萌發(fā)，到夏季即種子成熟，因此，生殖生長延緩，生活周期過長，不利于加快實驗進程。而室內(nèi)培養(yǎng)是將種子播撒于營養(yǎng)土、蛭石、素沙按體積比1∶1∶1均勻混合的培養(yǎng)介質(zhì)中，該方法使用的培養(yǎng)介質(zhì)既有擬南芥苗期根系生長所需的透水和透氣性，又能為擬南芥后期生長提供養(yǎng)分，且水、肥和氣均供應均衡一致，且室內(nèi)培養(yǎng)的成活率較高，生長健壯，生長發(fā)育進程快且整齊，因此能最好的發(fā)揮擬南芥?zhèn)€體小和生育期短的優(yōu)勢，降低生物實驗系統(tǒng)誤差。

許多文獻提出，微重力環(huán)境對于正常生長的植物來說是一個逆境條件，改變重力的大小和方向都會影響植物的代謝、生長、發(fā)育、繁殖及應激反應等［5，6］。植物在正常的重力下，根向下生長，莖向上生長。在微重力環(huán)境下，根的生長方向依種胚所處的方位而定。地上部生長取決于光源的位置，在微重力場中向光性彎曲更加明顯，因此，莖和根都呈現(xiàn)不定向生長，根呈彎曲狀。目前，已有多項研究表明模擬微重力會影響植物的細胞形態(tài)和植物細胞的亞顯微結構［7］。有人報道，太空飛行的豌豆幼苗根細胞變長，表面積變大，而細胞核變小。有研究者［8］采用馬鈴薯、香石竹、草莓及人參果的試管幼苗作為試驗材料，分別置于正常重力環(huán)境中和模擬微重力環(huán)境中，待生長8 d后，對4種植物的電鏡切片觀察發(fā)現(xiàn)，模擬微重力對植物細胞亞顯微結構產(chǎn)生了影響：細胞壁收縮呈不規(guī)則多角形，細胞之間聯(lián)結松散，而且葉綠體片層結構明顯彎曲、疏松和膨化，并且變得模糊。線粒體表面的膜粗糙、嵴不明顯、結構松散。Popova等［9］觀察了飛行10.5 d 和18 d 的小球藻細胞發(fā)現(xiàn)細胞分裂受到干擾，類囊體腔膨脹，葉綠體出現(xiàn)電子半透明區(qū)。同時，類囊體相對體積減小。黃偉等［8］觀察玉米在微重力下會導致細胞出現(xiàn)畸形核，這可能與細胞骨架遭到破壞有關。POD、SOD和CAT是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的3種重要保護酶，它們能夠有效阻止活性氧在植物體內(nèi)的積累。因此，POD、SOD和CAT活性的升高反映出植物在逆境下，能通過自身防御機制對有害物質(zhì)做出保護性應激反應［10-12］。我們的試驗結果表明，模擬微重力處理后3種抗氧化酶活性均有不同程度的提高，表明擬南芥幼苗對微重力刺激作出了保護性應激反應。而Vc是植物體內(nèi)抗氧化的成分，體內(nèi)活性氧的增加會導致Vc的含量發(fā)生變化，Vc的抗氧化功能同樣可以防止活性氧對植物組織的破壞。在防御應激過程中，植物體消耗了大量的Vc，因此，Vc含量的下降同樣也說明擬南芥幼苗對微重力刺激作出了保護性應激反應。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，具有細胞毒性，能引起細胞膜功能紊亂［13］。模擬微重力處理后，擬南芥體內(nèi)活性氧含量增加，導致MDA的升高，說明模擬微重力類似于逆境刺激。因此，造成MDA升高。鈣離子是真核生物中調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導的第二信使，鈣離子參與植物應激、抗逆、抗病等一系列刺激反應的調(diào)節(jié)［14，15］。有人研究了模擬微重力條件下的草莓和香石竹的株高、葉片數(shù)、葉綠素含量及光合速率發(fā)現(xiàn)，微重力對葉綠體的正常光合功能沒有顯著影響。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，重力改變時，擬南芥的鈣離子分布和濃度也發(fā)生改變，進而引起一系列的生物效應［15］。徐偉等［16］對微重力條件下蘆筍根尖鈣離子的分布的研究發(fā)現(xiàn)，微重力條件下根尖細胞鈣離子濃度比對照的鈣離子濃度低。本試驗結果顯示，模擬微重力環(huán)境下，擬南芥葉片的鈣離子濃度比對照的鈣離子濃度高，說明模擬微重力影響鈣離子的分布。這些結果表明鈣離子在植物的微重力效應過程中起到很大的作用。但是，根和葉片在模擬微重力條件下的鈣離子分布狀況有所不同，很可能是由于重力方向發(fā)生改變，鈣離子在植物組織細胞中進行移動，如果集中移動到根部，葉片中就減少了鈣離子，如果集中移動到根部，葉片就減少了鈣離子。結果顯示，模擬微重力，促使鈣離子移動到了葉片細胞中，徐偉等僅對玉米根尖鈣離子分布進行了觀察，未對葉片鈣離子分布進行檢測，所以，本試驗的結果和前人并不矛盾。Mari 等［17］以水蕨屬作為試驗材料，對其孢子進行了不同時間（包括1、8和20 h）的模擬微重力處理，提取RNA并進行實時定量RT-PCR，然后比較分析芯片結果，通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，1 h處理的孢子的2 110個基因中有3.46%基因位點發(fā)生改變，其中37個基因明顯上調(diào)，25個基因下調(diào)表達；8 h 處理的孢子的2 486個基因中有5.91%發(fā)生改變，其中70個明顯上調(diào)表達，42個下調(diào)表達；經(jīng)20 h處理的孢子的2 797個基因中有5.20%發(fā)生改變，其中有53個上調(diào)表達，48個下調(diào)表達［18］。對人腎細胞進行空間搭載后發(fā)現(xiàn)，有1 632個基因表達發(fā)生了明顯改變［19］。Barjaktarovi?等［20］對7 g處理1 h的擬南芥愈傷組織進行了基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，200多個基因表達明顯上調(diào)，他們還通過蛋白質(zhì)組學的方法發(fā)現(xiàn)，超重1 h處理的愈傷組織中有28個蛋白發(fā)生了明顯改變。

4 結論

本研究有關基因芯片分析結果或許可以說明，上述這些生理指標差異，很可能與模擬微重力處理的差異表達有關，處理6 d上調(diào)表達201個，下調(diào)表達249個；處理1 d 差異表達的基因，上調(diào)表達136個，下調(diào)表達229個，或許這些差異表達的基因是由微重力處理引起的，研究結果尚需進一步驗證。

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