竹節(jié)參培養(yǎng)細(xì)胞提取的竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的抑制作用

劉玉萍，王金萍，郭志剛*

1清華大學(xué)化工系，北京100084;2 北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京100700

竹節(jié)參(Panax japonicus C.A.Meyer)是五加科人參屬植物，以根狀莖及肉質(zhì)根入藥，性味甘苦、溫，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血化淤、消腫止痛的功效，是我國(guó)的名貴中藥材。由于竹節(jié)參的自然種群分布稀少，野生資源瀕臨滅絕，已被列為國(guó)家保護(hù)植物?？蒲腥藛T已經(jīng)從竹節(jié)參分離到多種化學(xué)成分。主要包括竹節(jié)參皂苷、氨基酸、糖類(lèi)及無(wú)機(jī)微量元素等［1］。劉家蘭等發(fā)現(xiàn)竹節(jié)人參提取物的鎮(zhèn)痛和中樞性鎮(zhèn)痛作用明顯［2］。閔靜等發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參皂苷具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有較好的抗炎作用［3］。王洪武等研究了竹節(jié)參皂苷與多糖組合物對(duì)免疫低下小鼠免疫功能有促進(jìn)作用［4］。劉玉萍等的研究證明了竹節(jié)參總皂苷具有良好的鎮(zhèn)痛作用［5］。

由于竹節(jié)參的產(chǎn)量很低，自然資源有限，本實(shí)驗(yàn)采用竹節(jié)參細(xì)胞培養(yǎng)提取的竹節(jié)參總皂苷，通過(guò)Wistar 大鼠構(gòu)建免疫炎癥病理模型，通過(guò)口服給藥，研究竹節(jié)參總皂苷對(duì)于Wistar 大鼠佐劑性免疫炎癥的治療效果。目的是了解由竹節(jié)參培養(yǎng)細(xì)胞獲得的竹節(jié)參皂苷在提高機(jī)體免疫力的效果。同時(shí)也驗(yàn)證竹節(jié)參總皂苷的藥效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Wistar 大鼠，雄性，體重180 ±10 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證號(hào)SCXK(京)-2006-0003。每組10 只，合計(jì)60 只。竹節(jié)參細(xì)胞培養(yǎng)總皂苷由清華大學(xué)化工系生物化工研究所提供。陽(yáng)性對(duì)照藥雷公藤多苷片由上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司提供，10 mg/片(批號(hào):060901)。弗氏完全佐劑由美國(guó) Sigma 公司提供，10 mL/支(批號(hào):124k8942)。

分別稱(chēng)取適量的竹節(jié)參總皂苷粉末，用0.5%Carboxymethyl cellulose-Na(CMC-Na)配成不同濃度:竹節(jié)參總皂苷的濃度分別為1、2、4 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照藥物雷公藤多苷的濃度為1 mg/mL。

1.2 病理模型構(gòu)建

1.2.1 佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型的制備［6］

將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥雷公藤多苷組、竹節(jié)參總皂苷高、中、低劑量組?？诜o藥，正常對(duì)照組和模型組給予等體積0.5% CMCNa，于末次給藥1 h 后每只動(dòng)物右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL 致炎。

1.2.2 給藥方案

1)致炎前5d 口服給藥，觀察藥物對(duì)原發(fā)性病變的預(yù)防效果;在致炎7 d 后連續(xù)用藥5 d，觀察藥物對(duì)原發(fā)性病變的治療作用;2)在致炎后第12 d 再次開(kāi)始連續(xù)用藥10 d，以觀察竹節(jié)參總皂苷對(duì)繼發(fā)病變的治療作用。3)陽(yáng)性藥組每日口服給雷公藤多苷40 mg/kg，竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組每日口服給藥分別為35、70 和140 mg/kg，正常對(duì)照組和模型組給予等體積0.5% CMC-Na。

1.2.3 AA 大鼠原發(fā)性病變觀察

測(cè)量致炎后第6、18 和24 h AA 大鼠的足腫脹度。觀察AA 大鼠原發(fā)性病變。

足腫脹度=(致炎后足體積﹣致炎前足體積)/致炎前足體積，用此公式來(lái)計(jì)算足腫脹度，此值反映原發(fā)性炎癥病變的影響。

1.2.4 AA 大鼠繼發(fā)性病變觀察

由于繼發(fā)性病變一般表現(xiàn)在致炎第10 d 以后，所以在致炎后第12 d 再次開(kāi)始連續(xù)口服給藥10 d，并于第3、12、15、18、21 和24 d 檢測(cè)致炎和非致炎側(cè)足的腫脹情況(測(cè)量大鼠左、右后足體積)，觀察藥物對(duì)AA 大鼠繼發(fā)性病變的治療效果，并計(jì)算非致炎側(cè)足的腫脹度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)AA 大鼠的體重、原發(fā)性足腫脹度、繼發(fā)性足腫脹度進(jìn)行了檢測(cè)和調(diào)查。數(shù)據(jù)為10 只實(shí)驗(yàn)大鼠的平均數(shù)和偏差，同時(shí)進(jìn)行了t 測(cè)驗(yàn)分析。

1.2.6 AA 大鼠的病理改變

于造模后第28 d 頸動(dòng)脈放血處死大鼠，取各組大鼠踝關(guān)節(jié)置于10%福爾馬林中固定，24 h 后換新福爾馬林繼續(xù)固定48 h。選取組織經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，切5 μΜ 薄片，HE 染色，光鏡檢查，并照相。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠體重的影響

在造模期間，各組大鼠體重均明顯逐步增加。結(jié)果見(jiàn)表1。竹節(jié)參總皂苷各劑量和陽(yáng)性藥雷公藤多苷給藥沒(méi)有對(duì)AA 大鼠的基本生長(zhǎng)發(fā)育造成傷害。由于模型組和各給藥組與對(duì)照組相比AA 大鼠的體重沒(méi)有顯著性差異，體重實(shí)驗(yàn)結(jié)果不存在系統(tǒng)性誤差。

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠體重的影響(±s，n=10)Table 1 Effects of PJTS on the weight of AA rats (±s，n=10)

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠體重的影響(±s，n=10)Table 1 Effects of PJTS on the weight of AA rats (±s，n=10)

組別Group劑量Dose(mg/kg)0 d3 d15 d18 d21 d24 d 12.4 ±27.3319.8 ±34.8336.3 ±36.7模型組Model－187.3 ± 6.8203.7 ± 9.2279.5 ±19.8308.4 ±25.0319.2 ±26.0333.7 ±29.3陽(yáng)性組Positive conturol40186.0 ± 7.7200.7 ±11.4282.0 ±22.4311.6 ±15.1320.2 ±23.4332.4 ±34.0低劑量PJTS low dose35184.7 ± 7.5205.2 ± 9.3283.7 ±12.2311.7 ±15.1320.2 ±23.4336.0 ±17.7中劑量PJTS Moderate dose70184.7 ± 6.6200.3 ± 9.2272.8 ±20.2302.3 ±23.6303.8 ±21.5325.4 ±22.4高劑量PJTS High dose140186.0 ± 7.7200.8 ±10.1276.5對(duì)照組Control－184.5 ±12.2208.5 ±16.6278.9 ±28.03±17.4297.0 ±34.9304.6 ±21.6326.9 ±25.1

2.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠原發(fā)性足腫脹度的影響

致炎前連續(xù)口服給藥5 d 后開(kāi)始致炎的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，除了對(duì)照組AA 大鼠原發(fā)性足腫脹度沒(méi)有變化之外，模型組、陽(yáng)性藥組與竹節(jié)參總皂苷各劑量組分別從致炎后開(kāi)始腫脹，第6 h 各組以模型組為最大的0.5，陽(yáng)性組和中劑量竹節(jié)參皂苷給藥組的腫脹度分別為0.3，顯著低于模型組。第12 h 后模型組的腫脹度達(dá)到0. 7，低劑量竹節(jié)參給藥組為0.6，而中劑量和高劑量給藥組的腫脹度只有0.4，顯著低于模型組和低劑量給藥組，并且好于陽(yáng)性組。第18 h 后模型組的腫脹度達(dá)到0.9，而中劑量竹節(jié)參皂苷給藥組的腫脹度維持在0.4，顯著低于模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性組。第24 h，模型組的腫脹度下降為0.7，而中劑量竹節(jié)參皂苷給藥組的腫脹度依然穩(wěn)定在0.4，顯著低于模型組和陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量組處理對(duì)于預(yù)防和治療AA 大鼠原發(fā)性足腫脹具有良好的效果，低劑量組和高劑量組的抗炎效果與陽(yáng)性藥組基本相同。表明竹節(jié)參皂苷對(duì)于AA 大鼠的原發(fā)性炎癥具有很好的預(yù)防和治療效果。

表2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠原發(fā)性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Table 2 Effects of PJTS on the primary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)

表2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠原發(fā)性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Table 2 Effects of PJTS on the primary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)

組別Group劑量dose(mg/kg)致炎后的足腫脹度(mL)Cause inflammation after of the foot degree (mL)0 h6 h12 h18 h24 h對(duì)照組Control-0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊模型組Model0.0 ±0.00.5 ±0.30.7 ±0.20.9 ±0.30.7 ±0.3陽(yáng)性組Positive control400.0 ±0.00.3 ±0.2*0.5 ±0.2*0.6 ±0.1*0.5 ±0.1*低劑量組PJTS low dose350.0 ±0.00.4 ±0.10.6 ±0.20.6 ±0.1*0.5 ±0.1*中劑量組PJTS Moderate dose700.0 ±0.00.3 ±0.1*0.4 ±0.2＊＊0.4 ±0.2＊＊0.4 ±0.1＊＊高劑量組PJTS High dose1400.0 ±0.00.4 ±0.10.4 ±0.1＊＊0.6 ±0.1*0.5 ±0.2*

2.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠繼發(fā)性足腫脹度的影響

竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠繼發(fā)性足腫脹度的消炎和治療實(shí)驗(yàn)自致炎后第12 d 起又繼續(xù)口服給藥，同時(shí)觀察AA 大鼠繼發(fā)性病變的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，在致炎后第12 d，模型組和低劑量竹節(jié)參皂苷給藥組的足腫脹度為0.5，陽(yáng)性藥組以及中、高劑量竹節(jié)參總皂苷給藥組的足腫脹度分別為0.3～0.4，表明在致炎前口服給藥5 d 的抗炎效果依然存在。模型組的個(gè)別大鼠有結(jié)節(jié)出現(xiàn)，并伴有體重減輕等癥狀。從致炎后第12 d 起開(kāi)始二次用藥，3 d后也就是在第15 d，模型組的足腫脹度降低到0.3，而陽(yáng)性藥組和低劑量竹節(jié)參皂苷給藥組的足腫脹度降低到0.1，中劑量和高劑量竹節(jié)參皂苷給藥組的足腫脹度降低到0。在用藥后第6 d(18 d)模型組的腫脹度仍然維持在0.3，陽(yáng)性藥組和低劑量給藥組的腫脹度也降低到0，極顯著地低于模型組的足腫脹度，表現(xiàn)出竹節(jié)參皂苷良好的消炎與消腫效果。致炎后第12 d 模型組與各處理組的原發(fā)性足腫脹度雖然均有所下降，但是仍維持在0.5～0.3 范圍內(nèi)。再次開(kāi)始給藥后，給藥組分別在第15 d 和18 d均徹底消除了足腫脹，達(dá)到了很好的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明竹節(jié)參總皂苷對(duì)于AA 大鼠繼發(fā)性炎癥具有很好的治療效果。

結(jié)合大鼠原發(fā)性與繼發(fā)性足腫脹的結(jié)果可以清楚地看到，自致炎開(kāi)始AA 大鼠的右足開(kāi)始腫脹，在第6 h，除了對(duì)照組之外，各處理組的AA 大鼠的原發(fā)性足腫脹度均達(dá)到了0.3～0.5，在第16 h 足腫脹度達(dá)到最高峰，之后開(kāi)始消腫。同時(shí)可以看到，在致炎前5 d 開(kāi)始口服給藥的AA 大鼠的足腫脹度均顯著低于模型組。表明竹節(jié)參皂苷和雷公藤多苷對(duì)于AA 大鼠的原發(fā)性炎癥具有很好的預(yù)防效果。在致炎后第12 d 模型組與各處理組的原發(fā)性足腫脹度雖然均有所下降，但是仍維持在0.5～0.3 的范圍內(nèi)。再次開(kāi)始給藥后發(fā)現(xiàn)，給藥組分別在第15 d和18 d 均徹底消除了足腫脹，達(dá)到了很好的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了竹節(jié)參總皂苷對(duì)于AA 大鼠原發(fā)性和繼發(fā)性炎癥都具有良好的治療效果。特別是中高級(jí)量的治療效果要優(yōu)于雷公藤多苷。

表3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠繼發(fā)性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)Table 3 Effects of PJTS on the secondary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)

表3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠繼發(fā)性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)Table 3 Effects of PJTS on the secondary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)

組別Group劑量Dose(mg/kg)致炎后的足腫脹度(mL)Cause inflammation after of the foot degree(mL)12 d15 d18 d對(duì)照組Control－0.1 ±0.1＊＊0.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊模型組Model－0.5 ±0.20.3 ±0.10.3 ±0.1陽(yáng)性組Positive control400.4 ±0.1*0.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊低劑量組PJTS Low dose350.5 ±0.10.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊中劑量組PJTS Moderate dose700.4 ±0.1*0.0 ±0.2＊＊0.0 ±0.1＊＊高劑量組PJTS High dose1400.3 ±0.1*0.0 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊

2.4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠足爪關(guān)節(jié)病理組織的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在光鏡下觀察足爪組織并攝片。病理分級(jí)為:0 級(jí):足爪組織結(jié)構(gòu)無(wú)名顯異常。Ⅰ級(jí):足爪組織有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Ⅱ級(jí):足爪組織有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Ⅲ級(jí):足爪組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴明顯間質(zhì)水腫。

足爪組織病理切片見(jiàn)圖1。對(duì)照組的關(guān)節(jié)滑膜組織由1～2 層滑膜細(xì)胞及滑膜下層組成，可見(jiàn)少許小血管，滑膜細(xì)胞排列整齊，關(guān)節(jié)面光滑，腔內(nèi)無(wú)滲出，屬于0 級(jí)無(wú)炎癥的正常組織。而AA 大鼠足爪模型組織的病理切片發(fā)現(xiàn)明顯有增生、肉芽腫、巨噬細(xì)胞，滑膜囊內(nèi)有大量炎性細(xì)胞，伴明顯間質(zhì)水腫，其病理分級(jí)屬于Ⅲ級(jí)。而竹節(jié)參總皂苷處理組和陽(yáng)性組的病理切片雖然存在輕微的細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，但是沒(méi)有增生和肉芽腫等嚴(yán)重間質(zhì)水腫發(fā)生。其病理分級(jí)應(yīng)該處于0～Ⅰ級(jí)之間。表明竹節(jié)參皂苷對(duì)于AA 大鼠的關(guān)節(jié)炎癥具有明顯的治療作用。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠足爪關(guān)節(jié)病理組織的影響(HE 染色，×100)Fig.1 Effects of PJTS on the foot claw joint pathology organization of AA rats

3 討論

炎癥(inflammation)是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。任何損傷因子在引起細(xì)胞和組織損傷的同時(shí)，也刺激生物體產(chǎn)生防御反應(yīng)。它是人類(lèi)疾病中一種最常見(jiàn)的病理、生理過(guò)程，可以發(fā)生于機(jī)體的任何部位和任何組織［7］。當(dāng)致炎因子作用于機(jī)體時(shí)，機(jī)體通過(guò)炎癥反應(yīng)消除致炎因子，保護(hù)機(jī)體免受異物或致病因素的損害，同時(shí)又通過(guò)自身抗炎機(jī)制限制炎癥的范圍，維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。整個(gè)過(guò)程中實(shí)際貫穿著兩對(duì)主要矛盾:損害與抗損害，炎癥與抗炎癥的斗爭(zhēng)，兩對(duì)矛盾關(guān)系密切，相互依賴(lài)，兩者的力量對(duì)比變化決定了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。機(jī)體在正常情況下，如果有病原體入侵，會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞活化、補(bǔ)體活化以及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。同時(shí)，會(huì)動(dòng)員機(jī)體自身抗炎機(jī)制限制這種活化，保護(hù)宿主免受炎癥損傷。結(jié)果是損害與抗損害，炎癥與抗炎癥在機(jī)體達(dá)成一種平衡，當(dāng)這一平衡由于外在因素(如致炎因子的強(qiáng)烈攻擊)或內(nèi)在因素(如自身抗炎機(jī)制減弱)而失調(diào)時(shí)，即可出現(xiàn)病理學(xué)上炎癥反應(yīng):紅、腫、熱、痛及肉芽組織形成。

大鼠AA 模型是一種免疫性炎癥模型，主要以細(xì)胞免疫功能紊亂而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷的一種關(guān)節(jié)炎模型。一般分兩個(gè)時(shí)相，即原發(fā)性和繼發(fā)性反應(yīng)期，其中原發(fā)性反應(yīng)為非特異性急性炎癥，而繼發(fā)性反應(yīng)則是免疫功能紊亂造成免疫性炎癥表現(xiàn)。本研究根據(jù)以往的成功經(jīng)驗(yàn)，選用Wistar 雄性大鼠右后足皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑造模，觀察竹節(jié)參總皂苷對(duì)AA 大鼠模型的影響。測(cè)量和觀察注射足的初始腫脹度以反映AA 大鼠原發(fā)性炎癥變化，當(dāng)注射完全弗氏佐劑18 h 后注射足腫脹達(dá)到高峰，以后腫脹度逐漸相對(duì)下降。觀察AA 大鼠繼發(fā)性病變的結(jié)果顯示，大鼠于致炎后第10 d 起其左足也開(kāi)始腫脹，第18 d 達(dá)到腫脹高峰，由于遲發(fā)型超敏反應(yīng)，使側(cè)后肢、前肢各關(guān)節(jié)周?chē)炔课痪霈F(xiàn)紅腫、紅斑、個(gè)別模型動(dòng)物出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié)，且進(jìn)行性加重，模型動(dòng)物伴有行動(dòng)不便等全身性癥狀。而口服竹節(jié)參總皂苷的大鼠不僅能有效抑制原發(fā)性炎癥，也明顯地抑制了AA 大鼠的繼發(fā)性炎癥。通過(guò)病理切片進(jìn)行組織學(xué)觀察，模型組的滑膜組織明顯增生，肉芽腫形成，巨噬細(xì)胞及滑膜囊內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨侵蝕及骨組織破壞，與人類(lèi)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)十分相似［8］。而口服竹節(jié)參總皂苷的大鼠明顯地減輕了關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的形成。該試驗(yàn)結(jié)果為解釋文獻(xiàn)記載的竹節(jié)參能夠治療風(fēng)濕痹癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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