硫化氫對(duì)代謝綜合征小鼠血糖和血胰島素水平的調(diào)節(jié)

陳玉涵 李榮娜 王紅霞 曾翔俊 郝 剛▲

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院消化科，北京 100069；2.河北秦皇島市第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北秦皇島 066001；

3.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069

1988 年，Reaven 首次提出X 綜合征又稱為胰島素抵抗綜合征或代謝綜合征（metabolic syndrome，MS），包括胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰島素血癥、 脂質(zhì)代謝紊亂以及高血壓等綜合的病理變化[1]。MS 是多基因和多種環(huán)境因素綜合作用所致的疾病，患病率逐年上升，已成為當(dāng)前社會(huì)嚴(yán)重威脅人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。 研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體可以內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）并完成一定的生理功能。生理濃度的H2S 與氣體分子一氧化氮、一氧化碳在部分生物學(xué)功能方面相同或相似，因此，它被看作體內(nèi)第三種的氣體信號(hào)分子。 H2S 是以L-半胱氨酸為底物，在胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶 （cystathionine-γ-lyase，CSE）的作用下產(chǎn)生，廣泛參與諸多的疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸[2]。研究表明， 外源性H2S 治療可減輕高糖引起的ROS 產(chǎn)物的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕DNA 的損傷[3]，外源性H2S 能抑制高濃度葡萄糖引起的心肌細(xì)胞損傷[4]，可以抑制胰島素分泌和成熟脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[5]。 筆者前期研究工作也發(fā)現(xiàn)，MS 小鼠內(nèi)源性H2S/CSE 體系受到嚴(yán)重抑制，因此推斷H2S 參與了MS 小鼠血糖和胰島素水平的調(diào)節(jié)。

基于以上問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選用KK/Upj-Ay/J 小鼠作為MS 小鼠動(dòng)物模型， 觀察H2S 供體NaHS 對(duì)血糖和血胰島素水平的影響，以及NaHS 對(duì)C2C12 骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響，并通過(guò)觀察NaHS 對(duì)小鼠胰島瘤細(xì)胞（NIT-1 細(xì)胞）胰島素分泌的影響，對(duì)機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

MS 模型雄性KK/Upj-Ay/J 小鼠（8～10 周）由中科院動(dòng)物所提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCKK2004-0001）；正常對(duì)照雄性C57BL/6J 小鼠（8～10 周）由中科院動(dòng)物所提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCKK2005-0013）；小鼠胰島瘤（NIT-1）細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室贈(zèng)予；小鼠C2C12 骨骼肌細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑

硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；2-脫氧熒光葡萄糖（2-NBDG，2-[N-（7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazo l- 4- yl）amino]-2-deoxy-D-glucose） 購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 8～10 周的雄性KK/Upj-Ay/J 小鼠隨機(jī)分為MS+NaHS 組和MS 組，每組各6 只。MS+NaHS組每日每只腹腔注射0.25 mL H2S 供體NaHS（78 μmol/kg）；MS 組每日每只注射等量生理鹽水。 取同周齡健康雄性C57BL/6J 小鼠10 只作為正常對(duì)照組（CON 組），注射等量生理鹽水。 連續(xù)給藥4 周。

1.3.2 空腹血糖和胰島素的測(cè)定 小鼠尾尖取血，強(qiáng)生ONE TOUCH Ultra 血糖儀測(cè)定血糖值。胰島素測(cè)定由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所采用放射免疫分析法完成。

1.3.3 肥胖指標(biāo)和血脂的測(cè)定 取材前腹腔注射4%水合氯醛麻醉（0.8 mL/100 g），測(cè)量體重、腹圍和體長(zhǎng)并計(jì)算Lee 指數(shù)。 體長(zhǎng)即小鼠麻醉后仰臥，從鼻尖到肛門的長(zhǎng)度。Lee's 指數(shù)=[體質(zhì)量（g）]1/3/體長(zhǎng)（cm）×1000。取腎周、 腸系膜、 附睪處脂肪稱重并計(jì)算脂肪系數(shù)（VFC）。 VFC （%）=內(nèi)臟脂肪濕重（viceral fat mass，VFM）/體重（BW）。做頸總動(dòng)脈插管取血，EDTA 抗凝，1500 r/min 離心10 min， 取上清液分裝入凍存管中，-80℃保存，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.4 2-NBDG 攝取實(shí)驗(yàn)[6]將小鼠C2C12 骨骼肌細(xì)胞株采用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)95%空氣5% CO237℃恒溫培養(yǎng)，取同批單層培養(yǎng)細(xì)胞吸去原培養(yǎng)液后，用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，換用含5%新生牛血清的培養(yǎng)基， 取同批單層培養(yǎng)細(xì)胞分為A、B、C、D、E 5 組， 分別加入不同濃度的NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培養(yǎng)1 h 后，棄去培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS 沖洗3 遍， 加入200 μmol/L 2-N BDG 培養(yǎng)20 min 后，棄去2- NBDG 液，0.01 mol/L PBS 沖洗3 遍，將玻片小心取出，放置在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)540 nm，可觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光。各濃度NaHS 組選3 個(gè)皿，每皿隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Imagepro Plus 6.0 軟件對(duì)熒光積分光密度（IA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.5 小鼠NIT-1 細(xì)胞胰島素分泌功能的測(cè)定[7]采用DMEM 培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)95%空氣5%CO237℃恒溫培養(yǎng)。 取同批單層培養(yǎng)細(xì)胞分別加入不同濃度NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培養(yǎng)1 h 后棄去培養(yǎng)液， 用含5.6 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 留取培養(yǎng)液，-20℃貯存，待測(cè)胰島素含量。 然后行葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn)，每個(gè)皿棄去培養(yǎng)液后加入含16.7 mmol/L 葡萄糖的KRBB 液刺激1 h后，留取培養(yǎng)液，待測(cè)胰島素含量。

1.3.6 MS 診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用2005 年4 月國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Dabetes Federation，IDF）頒 布 的MS國(guó)際統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)，即在中心性肥胖基礎(chǔ)上具備以下4 項(xiàng)中的任何2 項(xiàng)：三酰甘油水平升高，高密度脂蛋白膽固醇水平降低，血壓升高，空腹血糖升高[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MS 模型的評(píng)價(jià)

與CON 組小鼠相比，KK/Upj-Ay/J 小鼠的肥胖指標(biāo)：腹圍和Lee's 指數(shù)顯著增加；空腹血糖和胰島素水平分別增高236.9%和310.3%（P ＜0.01）； 血脂指標(biāo)中總膽固醇升高131%，三酰甘油升高141%，低密度脂蛋白膽固醇升高76%，高密度脂蛋白膽固醇水平升高160%（均P ＜0.01）（表1）， 符合MS 診斷標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明MS 模型選擇成功。

2.2 NaHS 對(duì)血糖和血胰島素水平的影響

給予NaHS 4 周后，MS+NaHS 組小鼠空腹血糖和胰島素比MS 組分別降低了24.2%和46.98%（P ＜0.05），提示NaHS 可以改善MS 的的高糖高胰島素水平。見(jiàn)表2。

2.3 NaHS 對(duì)骨骼肌細(xì)胞攝取2-NBDG 的影響

加入2-NBDG 20 min 后， 熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，不同濃度NaHS 干預(yù)后，骨骼肌攝取2-NBDG 增加，熒光IA 值C、D 組與A 組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），B、E 組與A 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），其由大到小排序依次為C 組＞D 組＞B組＞E 組＞A 組。 NaHS 濃度為100 mmol/L 時(shí)，骨骼肌攝取葡萄糖量達(dá)到最大值。 見(jiàn)圖1、2。

表1 代謝綜合征模型評(píng)價(jià)指標(biāo)（s）

表1 代謝綜合征模型評(píng)價(jià)指標(biāo)（s）

注：與CON 組比較，*P ＜0.01；FBG：空腹血糖；FIns：空腹胰島素；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

CON 組（n=10）MS 組（n=6）7.87±0.63 10.00±0.59*302.69±22.75 338.26±25.64*6.67±0.56 22.47±5.89*56.19±19.63 230.53±91.00*2.52±0.17 6.26±0.47*0.98±0.22 2.20±0.89*1.28±0.11 3.59±0.30*0.44±0.09 0.81±0.06*

表2 硫氫化鈉對(duì)代謝綜合征小鼠空腹血糖和胰島素的影響（s）

表2 硫氫化鈉對(duì)代謝綜合征小鼠空腹血糖和胰島素的影響（s）

注：與MS 組比較，#P ＜0.05

MS 組（n=6）MS+NaHS 組（n=6）22.47±5.89 17.03±6.77#230.53±91.00 122.22±33.04#

圖1 C2C12 細(xì)胞對(duì)2-NBDG 的攝?。ā?0）

圖2 各組2-NBDG 攝取的IA 值比較

2.4 NaHS 對(duì)NIT-1 細(xì)胞胰島素分泌功能的影響

在低糖（5.6 mmol/L 葡萄糖）刺激下，不同濃度NaHS對(duì)胰島細(xì)胞胰島素分泌水平無(wú)明顯影響。 在高糖（16.7 mmol/L 葡萄糖）刺激下，不同濃度NaHS 干預(yù)后，胰島素分泌水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），且隨著NaHS水平的升高，胰島素分泌水平下降越明顯。 見(jiàn)表3。

表3 不同濃度NaHS 對(duì)NIT-1 細(xì)胞胰島素分泌的影響（s）

表3 不同濃度NaHS 對(duì)NIT-1 細(xì)胞胰島素分泌的影響（s）

注：與NaHS 0 mmol/L 比較，*P ＜0.05

NaHS（mmol/L）0 50 100 200 400 5.6 16.7 13.5±0.2 16.3±2.1 13.2±0.5 14.2±0.8*12.2±1.3 13.4±1.2*12.8±0.6 13.1±0.8*12.3±1.2 12.7±1.0*

3 討論

與CON 組相比，KK/Upj-Ay/J 小鼠的肥胖指標(biāo)體重、腹圍、Lee's 指數(shù)和空腹血糖、胰島素以及三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均顯著升高（P <0.01），這與MS 診斷標(biāo)準(zhǔn)相符，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選用的MS模型是成功的。

近年來(lái)，H2S 在胰島素抵抗及糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到人們關(guān)注。在本實(shí)驗(yàn)中MS 組小鼠空腹血糖和胰島素水平均比CON 組顯著升高（P<0.05），而給予NaHS 4 周后，MS+NaHS 組小鼠血糖和胰島素分別比MS 組降低了24.2%和46.98%。 推測(cè)H2S 可能是通過(guò)增加胰島素靶器官對(duì)葡萄糖的攝取和利用來(lái)達(dá)到降低血糖的作用。 因此，本研究進(jìn)一步觀察了NaHS對(duì)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響，結(jié)果表明，不同濃度的NaHS 干預(yù)后， 骨骼肌攝取葡萄糖增加 （均P ＜0.05），NaHS 濃度為100 mmol/L 時(shí)， 骨骼肌攝取葡萄糖量達(dá)到最大值。 表明H2S 可以通過(guò)提高胰島素敏感性，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取來(lái)降低血糖。

高胰島素血癥是在胰島素抵抗的狀態(tài)下，胰島B細(xì)胞代償性分泌胰島素增加的結(jié)果，不僅會(huì)導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能的下降，還會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成，導(dǎo)致左心室肥厚[9]，是冠心病、高血壓、高血脂、Ⅱ型糖尿病、肥胖、腦卒中等共同的發(fā)病基礎(chǔ)。 研究表明，不同濃度的H2S 對(duì)胰島B 細(xì)胞具有不同作用，低濃度的H2S 可通過(guò)ATP 敏感性K 通道（KATP）和不依賴于KATP 通道的其他機(jī)制抑制胰島素釋放， 高濃度的H2S 可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路導(dǎo)致胰島B 細(xì)胞壞死[3，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性給予NaHS 后，小鼠血清胰島素水平均比MS 組降低（P ＜0.05），NIT-1 細(xì)胞在加入NaHS 后，胰島素分泌水平下降（P ＜0.05），且隨著外源性NaHS 濃度的增加，胰島素分泌下降越明顯，說(shuō)明外源性NaHS 還可以抑制MS 的高胰島素分泌。

綜上所述，H2S 可以通過(guò)提高胰島素敏感性，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取來(lái)降低血糖，從而改善了高血糖刺激高胰島素血癥發(fā)展的惡性循環(huán)，抑制胰島素分泌； 同時(shí)，H2S 在高糖條件下可以直接抑制胰島素分泌， 改善了MS 小鼠的高胰島素狀態(tài)。 另外，H2S 還作為體內(nèi)的“調(diào)停器”減輕高糖環(huán)境對(duì)胰島細(xì)胞造成的損害[11]。 因此，外源性H2S 可能通過(guò)多個(gè)方面在MS 小鼠中發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)的重要作用。

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