RNAi沉默Plk1對胰腺癌細胞系AsPC-1侵襲轉移的影響

喻春釗 余 翔 王興偉 駱霞崗 李 泉 竺 慧 王偉林

南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普通外科，江蘇南京 210011

胰腺癌是一種惡性程度高、進展迅速、手術切除率低、預后極差的惡性腫瘤，術后5 年生存率為3%～8%[1]。 究其原因主要是因為胰腺癌發(fā)現(xiàn)時已經處于局部中晚期，存在胰周臨近許多重要器官的直接浸潤和轉移， 如何進一步尋找更加有效的治療手段和方法，抑制胰腺癌的侵襲和轉移對于提高胰腺癌的治療效果和預防復發(fā)有著重要的作用和意義[2]。 人類Plk1 基因于1994 年由GoIsteyn 等[3]最先克隆報道，定位于16p12.3，mRNA 長約2.2 kb， 編碼的蛋白質分子量約為67 kd。 本研究以Plk1 為靶基因，采用RNAi 技術沉默Plk1 基因表達， 觀察其與胰腺癌細胞侵襲轉移能力的關系及對細胞凋亡的影響，以期為胰腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鼠抗人Plk1 單克隆抗體（美國Zymed 公司），兔抗人Plk1 多克隆抗體 （美國Calbiochem 公司），PCR 引物和shplk1-1、shplk1-2、shplk1-3、shplk1-4 由上海鈺森生生物試劑公司合成；小牛血清，RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司），RNA 酶A（RNaseA）（Sigma 公司），Trizol（MRC 公司），總RNA 提取試劑盒（美國Promega 公司），反轉錄試劑盒Reverse Transcription System（美國Promega 公司），Rneasy Mini Kit（美國QIAGEN 公司），DL2000 DNA Marker，RT-PCR 試 劑 盒TaKaRa Taq（日本TaKaRa 公司），孔板，24 孔板（Costar 公司），瓊脂糖（美國Merck 公司），細胞裂解用蛋白酶抑制劑混合片（Roche 公司），化學發(fā)光檢測試劑盒（安瑪西亞公司），Matrigel 膠購自美國BD 公司，Transwell 小室系統(tǒng)購自美國Coster 公司，產品其他常用試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

胰腺癌細胞株AsPC-1 購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫， 細胞分別置于含10%小牛血清， 抗生素（含100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素）和2 mmol/L 谷胺酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，在37℃、%CO2、濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d 傳代1 次。 實驗選用對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）混合消化液消化，用含10%的小牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋成單細胞懸液（106/mL）以4000 細胞/孔接種于6 cm 培養(yǎng)皿中進行實驗，將實驗分為對照組（未處理組）、空質粒組、shplk1-1 組、shplk1-2 組、shplk1-3 組、shplk1-4組， 應用Invitrogen 公司轉染試劑盒按說明書進行轉染，培養(yǎng)48 h 后提取總Plk1 RNA 和蛋白。

1.3 RT-PCR 檢測目的基因Plk1 mRNA 的表達

用Rneasy Mini Kit 試劑盒提取各實驗組細胞總RNA，按照Promega 公司的反轉錄試劑盒操作手冊進行反轉錄。 Plk1 引物序列：上游引物5'-AAGAGATCCCGGAGGTCCTA-3'；下游引物5'-TCATTCAGGAAA AGGTTGCC-3' 產物長度450 bp。 擴增條件： 預變性94℃5 min，94℃30 s，63℃45 s，72℃1 min，30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。 以β-actin 為內參，引物序列：上游引物5'-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3'；下游引物5'-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3' 產物長度219 bp。 PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠上分離，通過Bio-Rad 公司凝膠分析軟件分析條帶光密度。

1.4 Western blot 檢測目的基因Plk1 蛋白的表達

收集“1.3 項”下同期處理的細胞提取蛋白。 細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次后加入150 μL 細胞裂解液 （50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02%疊氮鈉，0.1%SDS，100 μg/mL 苯甲基磺酰氟，1 μg/mL Aprotinin，1% Nonidet P-40，0.5%去氧膽酸鈉）， 冰上靜置20 min。 用細胞刮匙將細胞從培養(yǎng)皿中刮落，收集于Ep 管中，置冰上超聲細胞粉碎儀超聲處理20 s。12 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清，用Bio-Rad公司的DC Protein Assay 試劑盒進行蛋白定量。 以總蛋白量20 μg/孔進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢，將凝膠上的蛋白用濕轉移法轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。 膜用含5%脫脂牛奶的TBS 室溫封閉1 h，TBS 洗3 遍，加以封閉液稀釋的抗Plk1 抗體（1∶200）和抗β-actin 抗體（1∶500），4℃過夜，TBS 洗3 遍，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗孵育 （1∶3000）1 h，ECL 化學發(fā)光，暗室曝光顯影，計算機分析。

1.5 Transwell 腫瘤細胞侵襲實驗

將放于4℃過夜融化的Matrigel 膠用無血清培養(yǎng)基按比例為1∶3 稀釋配成膠，將小室放在24 孔板內，每個小室加入80 μL 稀釋好的Matrigel 膠， 分3 次鋪，每次間隔10 min，每次鋪完膠后在37℃下干燥；最后一次干燥10 min 后，在上層小室內分別加入4組細胞（未處理組、空質粒組、shplk1-3 組和對照組）各100 μL（濃度為1×106/mL）個。 下層小室各加入10%的FBS，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h；每組細胞設3 個復孔，實驗重復3 次，棄去上室中的培養(yǎng)液，并擦去Matrigel 膠，濾膜冰甲醇固定1 min 后行蘇木精-伊紅染色（HE），棉棒輕輕擦去濾膜頂層的細胞，進行侵襲實驗結果觀察：各選擇5 個無重疊區(qū)，于高倍鏡（200×）下攝片，同時分別計數(shù)24 孔板中的細胞數(shù)，結果以均值表示。

1.6 細胞遷移實驗

取傳代48h 長勢良好的兩組細胞（空質粒組和shplk1-3 組）制備單細胞懸液，按1×105個細胞（500 μL）/孔將細胞加入6 孔板，5%CO2培養(yǎng)箱內于37℃孵育培養(yǎng)。采用劃痕法用消毒過的槍頭在80%匯合的單層細胞表面劃出一無細胞的細痕，用PBS 漂洗3 次以除去劃下的細胞，加入新鮮無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察12、24 h，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0 對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測各組細胞Plk1 mRNA 的含量

以β-actin 作為內對照， 比較Plk1 的條帶差異明顯，對照組、空質粒組、shplk1-1 組、shplk1-2 組、shplk1-3 組、shplk1-4 組的Plk1 mRNA 相對量分別為（2.38±0.19）、（2.14±0.16）、（1.96±0.14）、（1.82±0.17）、（1.22±0.12）、（1.56±0.15），shplk1 轉染各組Plk1 mRNA 的表達低于對照組和空質粒組， 其中以shplk1-3組Plk1 mRNA 相對量最低，與各組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測各組細胞Plk1 mRNA 含量比較

2.2 Western blot 法測定Plk1 蛋白的表達

以β-actin 為內參，可見68 kd 左右的蛋白帶，它與Plk1 抗體特異性結合，證明為Plk1 表達的蛋白，對照組、 空質粒組、shplk1-1 組、shplk1-2 組、shplk1-3組、shplk1-4 組的Plk1 相對量分別為（1.243±0.143）、（1.122±0.121）、（0.953±0.018）、（0.775±0.020）、（0.275±0.154）、（0.543±0.125），shplk1 轉染各組Plk1 蛋白相對量相對較低， 其中以shplk1-3 轉染組顯著低于其它各組（P < 0.01）。 見圖2。

圖2 Western blot 檢測各組細胞Plk1 蛋白表達比較

2.3.Transwell 侵襲實驗

對照組、 空質粒組、shplk1-3 組穿過人工基底膜的侵襲細胞數(shù)分別為（195±16）、（176±13）、（83±5）個（圖3）。 結果顯示， 穩(wěn)定轉染后的shplk1-3 組穿過Matrigel 膠的侵襲細胞數(shù)較空質粒組和對照組明顯減少（圖4），方差分析顯示差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；而其余兩組組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

圖3 三組細胞侵襲能力比較

圖4 三組細胞穿過人工基底膜圖

2.4 細胞遷移實驗

在兩組細胞內劃出相同寬度的痕跡后，空質粒組比shplk1-3 組細胞遷移速度快，12 h 后，空質粒組已侵入近1/2 距離，而shplk1-3 組僅侵入1/3 左右，24 h后空質粒組已經基本融合，而shplk1-3 組僅侵入1/2左右（圖5）。 結果表明，shplk1 組細胞遷移能力明顯低于對照組。

圖5 兩組細胞在0、12、24 h 的遷移圖

3 討論

胰腺癌是一種惡性度很高的腫瘤，臨床上雖然采取了手術、化療、放療等多種治療方法，但療效卻不十分理想，重要原因是胰腺癌發(fā)現(xiàn)時已經處于局部浸襲和轉移，進一步研究和探討胰腺癌侵襲轉移的作用機制仍然是胰腺癌治療研究領域的難點和熱點[4]。 RNAi技術在腫瘤上的研究已經取得較大進展，目前大多數(shù)學者通過RNAi 沉默癌基因、 促進腫瘤細胞的凋亡、調控細胞周期、對腫瘤新生血管的干預以及對參與腫瘤放化療過程中與耐藥相關的特定基因的干預來研究腫瘤中特定基因的功能與探索相關的治療手段[5]。多項研究表明，Plk-1 在胰腺癌、直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌甲狀腺癌、鼻咽癌、子宮頸癌、肝轉移癌及前列腺癌組織中過表達，其過表達與腫瘤組織分級、惡性程度及預后密切相關[6-11]。 Plk-1 是一種存在于哺乳動物細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶， 通過參與調控細胞周期G2/M 期檢測點的功能對細胞周期的運行發(fā)揮重要作用，Plk-1 對控制細胞基因組的穩(wěn)定性和染色體分配能有效抑制腫瘤細胞增殖與分裂，Plk1 已被作為重要的分子藥物治療靶點[12-14]。 筆者前期研究已經發(fā)現(xiàn)， 中心體Plk1 在胰腺癌組織細胞中的高表達與其多藥耐藥機制密切相關，用RNAi 技術降低Plk1 的表達增強胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性[5，15]。 但是通過下調Plk1 的表達能否抑制胰腺癌細胞的侵襲和轉移能力目前沒有報道，因此本研究采用RNAi 干預Plk1 的表達， 研究靶向抑制Plk1 治療胰腺癌的可行性， 為胰腺癌的治療尋找一種新方法[16]。在本試驗中， 采用針對Plk1 的RNAi 來干預Plk1 的表達， 通過檢測轉染shplk1 的胰腺癌細胞， 來進行Plk1 mRNA、Plk1 蛋白質表達的檢測，發(fā)現(xiàn)在轉染shplk1-3 的AsPC-1 細胞中Plk1mRNA 和蛋白質水平明顯低于未處理組、空質粒組和對照組，表明構建的shplk1-3 能夠明顯的抑制Plk1 的表達； 同時對該株細胞進行了細胞遷移和侵襲實驗， 發(fā)現(xiàn)與空質粒組、未轉染組以及對照組相比，轉染shplk1-3 的AsPC-1，生長明顯變慢、活性降低、侵襲能力減弱，顯示出其對胰腺癌細胞良好的干預作用。 從而進一步證明Plk1可以作為胰腺癌治療的一個良好靶點， 提示對Plk1的干擾可能是一個有深遠前景的治療腫瘤的策略。

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