滸苔干粉末提取物對(duì)東海原甲藻和中肋骨條藻的克生作用

韓秀榮，高 嵩，侯俊妮，李鴻妹，石曉勇，3，*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青島 266100;2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266100;3.國(guó)家海洋局減災(zāi)中心，北京 100194)

在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，大型藻類對(duì)防止水體富營(yíng)養(yǎng)化，凈化水體起著重要的作用［1］，是海洋生態(tài)系統(tǒng)極其重要的生物調(diào)節(jié)因子［2］。另外，很多大型藻類都能向海洋分泌釋放出多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中包括不飽和脂肪酸、糖苷、硫化物、多酚、以及萜類等化合物［3］。這些化合物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中承擔(dān)著十分重要的角色［4-5］。這些大型藻類產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物通常具有某些特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生理功能，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的其他藻類起到一定的克生作用［6-11］。目前針對(duì)海洋中大型藻體內(nèi)克生物質(zhì)的提取、分離以及鑒定和這些克生物質(zhì)在實(shí)際中的應(yīng)用已經(jīng)成為海洋生態(tài)環(huán)境研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一［4，12-17］。

近年來(lái)綠潮災(zāi)害在我國(guó)多次暴發(fā)，給沿海經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人們的生活造成了很大影響。自2007年在黃海海域首次出現(xiàn)小規(guī)模綠潮之后，2008—2012年又連續(xù)暴發(fā)大規(guī)模綠潮［18-21］。作為黃海海域綠潮的主要藻種－滸苔，目前對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取與應(yīng)用的研究較少。

本研究通過(guò)不同極性的溶劑對(duì)滸苔干粉末進(jìn)行萃取，收集提取物。并以東海原甲藻及中肋骨條藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用不同溶劑的滸苔提取物，在不同濃度的添加情況下，分別研究對(duì)這兩種赤潮藻生長(zhǎng)的克生作用。通過(guò)在不同條件下對(duì)這兩種常見(jiàn)赤潮藻生長(zhǎng)克生作用的分析，為滸苔藻體內(nèi)克生物質(zhì)的分離、鑒定以及利用提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 滸苔

實(shí)驗(yàn)所用的滸苔均采自青島沿海，滸苔采集后除去雜藻，用經(jīng)醋酸纖維濾膜(孔徑0.45μm)過(guò)濾后的滅菌(120℃，20 min)海水反復(fù)清洗，以除去藻體中泥沙及其它雜物。將其培養(yǎng)于已滅菌(120℃，20 min)的錐形瓶中，用滅菌海水配置的f/2培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(20±1)℃;光照強(qiáng)度為4000 lx;光照周期為L(zhǎng)∶D=12 h∶12 h。每天定時(shí)晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，每隔3d更換新的培養(yǎng)液。

培養(yǎng)若干天后從培養(yǎng)瓶中挑選生長(zhǎng)良好的滸苔藻體，用滅菌海水沖洗4—5次，然后用滅菌濾紙吸干藻體表面的水分，在常溫下干燥5d左右(期間對(duì)藻體進(jìn)行多次稱量，以確定干燥完全至恒重，干濕比約為1∶4.4)，然后用瑪瑙研缽研磨成粉末，過(guò)篩(粒徑小于0.2 mm)待用。

1.1.2 赤潮藻

實(shí)驗(yàn)用的東海原甲藻和中肋骨條藻均取自中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室，培養(yǎng)介質(zhì)與培養(yǎng)條件與1.1.1中滸苔藻體一致。

1.2 滸苔干粉末提取物的制備

1.2.1 蒸餾水提取物

稱取10.0 g上述滸苔干粉末放置于500 mL錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水，搖晃均勻。常溫下用超聲波法提取2 h，靜置12 h。常溫下再用超聲波法提取2 h，然后用離心機(jī)分離(7500 r/min，15 min)，收集上層的提取液。下層粉末殘?jiān)侔瓷鲜龇椒ㄌ崛?次，合并兩次上層提取液。將收集的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，獲得淡綠色膏狀物質(zhì)，加入蒸餾水后定容至25.00 mL，此時(shí)濃度以400 g/L表示(即400 g滸苔干粉末組織提取物溶于1 L蒸餾水中)，最后置于冰箱冷藏(4℃)備用。

1.2.2 有機(jī)溶劑提取物的制備

選用3種極性不同的有機(jī)溶劑:甲醇、乙酸乙酯、正己烷(極性由高至低)，分別對(duì)5.0 g滸苔干粉末進(jìn)行提取，得到相應(yīng)的提取物。提取方法及條件與1.2.1中蒸餾水提取一致。然后分別將所得提取物用二甲基亞砜Dimethy lsulfoxide(DMSO)定容至10 mL，濃度以500 g/L表示(即500 g滸苔干粉末組織提取物溶于1 L有機(jī)溶劑中)，置于冰箱冷藏(4℃)備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)條件同1.1.1中滸苔培養(yǎng)條件一致。每天定時(shí)晃動(dòng)培養(yǎng)瓶?jī)纱危乐钩喑痹遒N壁生長(zhǎng)。為降低光照條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，每?jī)商鞂⑴囵B(yǎng)瓶進(jìn)行位置互換。

1.3.1 溶劑檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

將梯度為 0，1，5，10，20，25，50，100，200 μL 的 DMSO 分別加入到 100 mL 錐形瓶中，然后加入 f/2 培養(yǎng)液以及兩種赤潮藻的藻液，混合液的總體積為 20 mL，濃度梯度分別為 0，0.05，0.25，0.50，1.00，1.25，2.50，5.00，10.00 g/L。其中東海原甲藻和中肋骨條藻的接種密度均為5.5×104個(gè)/mL。各實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3組，實(shí)驗(yàn)周期為9 d。

1.3.2 蒸餾水提取物對(duì)兩種赤潮藻生長(zhǎng)的影響

將預(yù)先制備好的滸苔干粉末的蒸餾水提取物(濃度 400 g/L)以梯度為 0，0.06，0.12，0.25，0.50，1.00 mL分別加入到100 mL錐形瓶中，然后加入f/2培養(yǎng)液以及兩種赤潮藻的藻液，混合液的總體積為20 mL?；旌弦褐袧G苔干粉末的蒸餾水提取物的濃度梯度分別為 0，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 g/L。東海原甲藻和中肋骨條藻的接種密度均為5.5×104個(gè)/mL。各實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3組，實(shí)驗(yàn)周期為9 d。

1.3.3 有機(jī)溶劑提取物對(duì)兩種赤潮藻生長(zhǎng)的影響

將預(yù)先制備好的滸苔干粉末的有機(jī)溶劑提取物(濃度500 g/L)以梯度為 0，1，5，10，20，25，50，100 μL分別加入到100 mL錐形瓶中，然后加入f/2培養(yǎng)液以及兩種赤潮藻的藻液，混合液的總體積為20 mL?；旌弦褐袧G苔干粉末的有機(jī)溶劑提取物的濃度梯度分別為 0，0.03，0.13，0.25，0.5，0.63，1.25，2.50 g/L。東海原甲藻和中肋骨條藻的接種密度也均為5.5×104個(gè)/mL。各實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3組，實(shí)驗(yàn)周期為9 d。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 赤潮藻的日平均生長(zhǎng)率、抑制率P'與半效應(yīng)濃度EC50

每天的固定時(shí)間用光學(xué)顯微鏡，采用浮游生物計(jì)數(shù)框的計(jì)數(shù)方法得出赤潮藻的細(xì)胞密度。赤潮藻的日平均生長(zhǎng)率(υs，%/d)的計(jì)算公式如下:

式中，N0和Nt分別是實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第t天時(shí)的赤潮藻的細(xì)胞密度。

表1 滸苔對(duì)赤潮藻克生作用實(shí)驗(yàn)中所設(shè)置的實(shí)驗(yàn)條件Table 1 The experimental conditions in the assays for the effects of Enteromorpha on red-tide microalgae

抑制率P'(%)的計(jì)算公式如下:

式中，B0-control為對(duì)照組赤潮藻的起始藻種密度;Bt-control為對(duì)照組的赤潮藻t時(shí)刻的藻種密度。Bt為實(shí)驗(yàn)組的赤潮藻t時(shí)刻的藻種密度。

EC50是指在一定時(shí)間內(nèi)(如72 h，96 h等)，浮游植物的相對(duì)生長(zhǎng)率減少50%時(shí)毒性物質(zhì)的濃度。EC50的值越小，說(shuō)明毒性越大。EC50能夠簡(jiǎn)單、明確的表示物質(zhì)對(duì)浮游植物的生物毒性，因此在生物毒性學(xué)中是一個(gè)重要的參數(shù)，并得到了廣泛應(yīng)用。本研究半效應(yīng)濃度EC50值采用內(nèi)插直線法計(jì)算，為72 h的EC50值。

1.4.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑DMSO檢驗(yàn)結(jié)果

不同的DMSO添加對(duì)東海原甲藻和中肋骨條藻兩種赤潮藻生長(zhǎng)的影響如圖1所示。從圖中可以明顯看出，不同梯度添加DMSO的實(shí)驗(yàn)組中的這兩種赤潮藻的生長(zhǎng)曲線均與對(duì)照組(0 g/L DMSO添加量)呈現(xiàn)出相似的增長(zhǎng)趨勢(shì)。由圖中可知中肋骨條藻的增長(zhǎng)較東海原甲藻速度快，藻種密度平均高一個(gè)數(shù)量級(jí)。用軟件SPSS16.0對(duì)兩種赤潮藻實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞密度進(jìn)行t-test檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)，結(jié)果表明這兩種赤潮藻的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間均沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。說(shuō)明溶劑DMSO對(duì)這兩種赤潮藻的生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響，以下實(shí)驗(yàn)可以用該試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 二甲基亞砜對(duì)東海原甲藻和中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of Dimethy lsulfoxide(DMSO)on Prorocentrum donghaiense and Skeletonema costatum

2.2 滸苔干粉末提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的影響

滸苔干粉末的蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的影響如圖2及表2所示。由圖2可知，與對(duì)照組(0 g/L添加)相比，較低濃度(1.25 g/L添加)的滸苔干粉末蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。較高濃度(＞1.25 g/L的添加)的滸苔干粉末蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)有抑制作用。也證實(shí)了對(duì)克生作用(Allelopathy)的定義:有利或有害的相互作用。其中由于克生物質(zhì)濃度的不同，產(chǎn)生的作用也可能會(huì)不同，抑制或者促進(jìn)生長(zhǎng)。

圖2 添加了不同濃度滸苔干粉末提取物的東海原甲藻的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth of Prorocentrum donghaiense in the presence of different concentrations of extracts

由圖2可知，濃度為1.25 g/L的滸苔干粉末蒸餾水提取物的添加組中東海原甲藻較快的進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，并且比對(duì)照組的生長(zhǎng)更快。濃度為2.50 g/L的蒸餾水提取物的添加對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)有著明顯的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中東海原甲藻的增長(zhǎng)緩慢，始終沒(méi)有進(jìn)入明顯的指數(shù)生長(zhǎng)期。說(shuō)明開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)東海原甲藻產(chǎn)生抑制作用的濃度在1.25 g/L與2.50 g/L之間，此外，蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻的72 h EC50值為1.79 g/L。推測(cè)滸苔干粉末蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度為1.50 g/L。濃度≥5.00 g/L的滸苔干粉末蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻有著極其顯著的抑制效應(yīng)，東海原甲藻的藻體在3 d內(nèi)全部死亡，具有短期致死效應(yīng)。5.00、10.00、20.00 g/L的蒸餾水提取物物組的東海原甲藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)一致，說(shuō)明5.00 g/L的蒸餾水提取物是影響東海原甲藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度，大于等于該值時(shí)對(duì)藻體表現(xiàn)為短期致死的效應(yīng)。從表2中的抑制率可以得到同樣結(jié)果。

滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖2與表2所示。較低濃度(0.03 g/L)的滸苔甲醇提取物的添加與對(duì)照組相比，東海原甲藻的生長(zhǎng)曲線基本一致，幾乎對(duì)藻體沒(méi)有影響。由表2所示，隨著提取物添加濃度的增大，東海原甲藻的生長(zhǎng)受到的抑制作用逐漸顯著，抑制率逐漸增大，日平均生長(zhǎng)率依次降低，實(shí)驗(yàn)?zāi)〇|海原甲藻的藻密度減少。當(dāng)添加濃度增至0.13 g/L時(shí)即表現(xiàn)出了對(duì)藻體相對(duì)明顯的抑制作用，藻體的指數(shù)增長(zhǎng)期極不明顯。此外，滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻的72 h EC50值為0.16 g/L。由此推測(cè)滸苔甲醇蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度約為0.10 g/L。由圖2所示，當(dāng)添加濃度為0.25 g/L時(shí)則對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出了極其強(qiáng)的抑制作用，由表2得出此時(shí)藻體的日平均生長(zhǎng)率僅為1%。當(dāng)添加濃度≥0.50 g/L時(shí)則對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的致死效應(yīng)，3 d內(nèi)致使東海原甲藻藻體全部死亡。說(shuō)明0.50 g/L的甲醇提取物添加是影響東海原甲藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度，大于等于該值時(shí)對(duì)藻體表現(xiàn)為短期致死的效應(yīng)，從表2中的抑制率也可以得到同樣結(jié)果。

表2 滸苔干粉末不同溶劑提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)影響的比較Table 2 The effection of different solvent extracts of Enteromorpha on Prorocentrum donghaiense

滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖2所示。與滸苔甲醇提取物添加實(shí)驗(yàn)中東海原甲藻生長(zhǎng)曲線比較相似，同樣表現(xiàn)為較低濃度(0.03 g/L)時(shí)對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的影響不顯著。由表2所示藻體的日平均生長(zhǎng)率以及實(shí)驗(yàn)?zāi)┑脑迕芏染c對(duì)照組基本相同。較高濃度添加時(shí)也與甲醇提取物添加實(shí)驗(yàn)中東海原甲藻生長(zhǎng)曲線比較相似。此外，滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻的72 h EC50值為0.14 g/L。由此推測(cè)滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度約為0.10 g/L。這與滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻的起始抑制濃度相近，此外，滸苔干粉末乙酸乙酯提取物添加影響東海原甲藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度與甲醇提取物相似，也為0.50 g/L。

滸苔正己烷提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖2所示。從圖中東海原甲藻的生長(zhǎng)曲線可以看出，濃度為0.03 g/L的正己烷提取物添加和0.13 g/L的正己烷提取物添加對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)的影響作用較小。其中濃度為0.03 g/L的正己烷提取物添加對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)為較小的促進(jìn)作用，濃度為0.13 g/L的正己烷提取物添加可對(duì)東海原甲藻產(chǎn)生則表現(xiàn)為不太顯著的抑制作用。濃度增至為0.25 g/L的正己烷提取物添加時(shí)，對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)表現(xiàn)出較顯著的抑制作用。由表2所示，此時(shí)東海原甲藻的日平均生長(zhǎng)率為48.8%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組東海原甲藻日平均生長(zhǎng)率(131.7%)，但又遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)0.25 g/L的甲醇或乙酸乙酯提取物添加的東海原甲藻的日平均生長(zhǎng)率(1.0%和2.4%)。此外，滸苔正己烷提取物對(duì)東海原甲藻的72 h EC50值為0.24 g/L。綜上推測(cè)滸苔正己烷提取物對(duì)東海原甲藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度約為0.15 g/L。當(dāng)濃度為0.50 g/L滸苔正己烷提取物添加時(shí)，則對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，生長(zhǎng)極其緩慢。由表2得出此時(shí)藻體的日平均生長(zhǎng)率僅為3.7%。當(dāng)濃度為≥0.63 g/L的正己烷提取物添加時(shí)，則對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的致死效應(yīng)，3 d內(nèi)致使東海原甲藻藻體全部死亡，濃度高時(shí)則2 d內(nèi)使藻體致死。說(shuō)明0.63 g/L的正己烷提取物是影響東海原甲藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度。

綜上，并且由表2中所列不同極性溶劑的滸苔提取物添加時(shí)，東海原甲藻日均生長(zhǎng)率及對(duì)其的抑制率等參數(shù)所示，可以看出各溶劑滸苔提取物對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)作用有著明顯的差異。其中，蒸餾水的提取物需要較高的添加濃度才會(huì)對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，說(shuō)明蒸餾水的提取效果比有機(jī)溶劑差。濃度為0.03 g/L(約需新鮮滸苔藻體0.11 g濕重/L)有機(jī)溶劑提取物添加時(shí)東海原甲藻的生長(zhǎng)有著輕微差異，其中甲醇和乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)影響較小，與對(duì)照組相比有著極小的抑制作用;而此濃度正己烷提取物對(duì)東海原甲藻則表現(xiàn)為一定的促進(jìn)作用。濃度較高的提取物添加則對(duì)東海原甲藻均表現(xiàn)為不同程度的抑制作用。蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷滸苔提取物影響東海原甲藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度分別為5.00、0.50、0.50、0.63 g/L(相當(dāng)于滸苔新鮮藻體濃度為 22.00、2.20、2.20、2.75 g 濕重/L)。說(shuō)明甲醇、乙酸乙酯的對(duì)滸苔干粉末的提取液對(duì)東海原甲藻的克生作用最為明顯，其次是正己烷，最差的是蒸餾水提取液。此外，由滸苔各個(gè)溶劑提取物對(duì)東海原甲藻的72 h EC50值能得出相同的結(jié)論。

2.3 滸苔干粉末提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響

圖3 添加了不同濃度滸苔干粉末提取物的中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth of Skeletonema costatum in the presence of different concentrations of extracts

滸苔干粉末的蒸餾水提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響如圖3及表3所示。從圖3的中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線可以看出，與對(duì)照組(0 g/L添加)相比，較低濃度(1.25 g/L添加)的滸苔干粉末蒸餾水提取物對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響，兩條生長(zhǎng)曲線基本一致。隨著提取物添加濃度的增加，可以看出中肋骨條藻的生長(zhǎng)受到的抑制效應(yīng)逐漸增大，并且梯度十分明顯。初步由表3可以看出日平均生長(zhǎng)率降低，中肋骨條藻的日平均生長(zhǎng)率由2.50 g/L添加濃度的795.0%降至10.00 g/L添加濃度的433.9%。由圖推測(cè)滸苔蒸餾水提取物對(duì)中肋骨條藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度約為1.50 g/L。此外，由表3可知，滸苔蒸餾水提取物對(duì)中肋骨條藻的72 h EC50值為11.74 g/L。當(dāng)濃度為20.00 g/L的蒸餾水提取物添加時(shí)，中肋骨條藻藻體在實(shí)驗(yàn)1 d就被全部殺死。說(shuō)明20.00 g/L的蒸餾水提取物添加是影響中肋骨條藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度，大于等于該值時(shí)對(duì)藻體表現(xiàn)為短期致死的效應(yīng)。從表3中的抑制率可以得到同樣結(jié)果。

表3 滸苔干粉末不同溶劑提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)影響的比較Table 3 The effection of different solvent extracts of Enteromorpha on Skeletonema costatum

滸苔甲醇提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖3與表3所示。較低濃度(0.03 g/L)的滸苔甲醇提取物的添加與對(duì)照組相比，中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線基本一致，此添加濃度對(duì)藻體生長(zhǎng)的影響不顯著(P＞0.05)。由表3所示，隨著提取物添加濃度的增大，中肋骨條藻的生長(zhǎng)受到的抑制作用逐漸顯著，且抑制率逐漸增大，日平均生長(zhǎng)率依次降低。當(dāng)添加濃度增至0.13 g/L時(shí)即表現(xiàn)出了對(duì)藻體有著不太明顯的抑制作用，藻體進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期不太明顯。由圖3推測(cè)滸苔蒸餾水提取物對(duì)中肋骨條藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度約為0.10 g/L。此外，滸苔甲醇提取物對(duì)中肋骨條藻的72 h EC50值為0.22 g/L。由圖3可以看出，當(dāng)濃度為0.25 g/L滸苔甲醇提取物的添加時(shí)則對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出了極其強(qiáng)的抑制作用，由表3得出此時(shí)中肋骨條藻藻體的日平均生長(zhǎng)率僅為385.5%。遠(yuǎn)小于對(duì)照組的1085.9%。為濃度0.50 g/L與0.63 g/L滸苔甲醇提取物的添加時(shí)則對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)，生長(zhǎng)極其緩慢，藻體的日平均增長(zhǎng)率分別為40.8%和10.4%。當(dāng)添加濃度≥1.25 g/L時(shí)則對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的致死效應(yīng)，2 d內(nèi)致使東海原甲藻藻體全部死亡。說(shuō)明1.25 g/L的甲醇提取物添加是影響中肋骨條藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度，大于等于該值時(shí)對(duì)藻體表現(xiàn)為短期致死的效應(yīng)。從表3中的抑制率也可以得到同樣結(jié)果。

滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖3與表3所示。低濃度添加濃度(0.03 g/L)時(shí)與甲醇提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響程度相似，對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響作用不明顯。濃度為0.13 g/L的滸苔的乙酸乙酯提取物對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)有較明顯的抑制作用，從生長(zhǎng)曲線可以看出進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期不是很明顯。由圖3推測(cè)滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)中肋骨條藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度也約為0.10 g/L。此外，滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)中肋骨條藻的72 h EC50值為0.19 g/L。在0.25 g/L的濃度添加時(shí)抑制效果更加明顯，當(dāng)增至0.50 g/L與0.63 g/L濃度的滸苔乙酸乙酯提取物添加時(shí)，對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生極其強(qiáng)烈的抑制作用，使其無(wú)法正常自然生長(zhǎng)，中肋骨條藻的日平均生長(zhǎng)率分別為40.8%和6.1%。當(dāng)濃度達(dá)1.25 g/L時(shí)，短期內(nèi)即可使中肋骨條藻全部死亡。說(shuō)明1.25 g/L的乙酸乙酯提取物添加是影響中肋骨條藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度，大于等于該值時(shí)對(duì)藻體表現(xiàn)為短期致死的效應(yīng)。

滸苔正己烷提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖3所示。從圖中中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線可以看出，濃度為0.03 g/L的正己烷提取物添加對(duì)東海原甲藻的生長(zhǎng)的影響作用較小，表現(xiàn)為較小的促進(jìn)作用。濃度為0.13、0.25、0.50、0.63 g/L的滸苔正己烷提取物添加時(shí)東海原甲藻的生長(zhǎng)曲線極其相似。表現(xiàn)為極小的抑制作用，從表3可得此時(shí)東海原甲藻的日均生長(zhǎng)率分別為869.7%、844.8%、811.1%、801.6%，也對(duì)照組(0 g/L添加)的日均生長(zhǎng)率1085.9%相差很小。由圖3推測(cè)滸苔正己烷提取物對(duì)中肋骨條藻開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用的閾值濃度約為0.15 g/L。此外，滸苔正己烷提取物對(duì)中肋骨條藻的72 h EC50值為0.81 g/L。濃度增至為1.25 g/L的正己烷提取物添加時(shí)，對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)表現(xiàn)出較顯著的抑制作用。由表3所示，此時(shí)中肋骨條藻的日平均生長(zhǎng)率為415.8%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組中肋骨條藻的日平均生長(zhǎng)率1085.9%。但與此濃度的甲醇或乙酸乙酯提取物添加對(duì)中肋骨條藻有短期致死的現(xiàn)象相比，滸苔正己烷提取物添加時(shí)中肋骨條藻的生長(zhǎng)相對(duì)還是相對(duì)較快的。當(dāng)濃度為2.50 g/L的正己烷提取物添加時(shí)，則對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的致死效應(yīng)，3 d內(nèi)致使中肋骨條藻藻體全部死亡，濃度高時(shí)則2 d內(nèi)致死。說(shuō)明2.50 g/L的正己烷提取物添加是影響中肋骨條藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度。

綜上，并且由表3中所列不同溶劑的滸苔提取物添加時(shí)，中肋骨條藻日均生長(zhǎng)率及對(duì)其的抑制率等參數(shù)所示，可以看出各溶劑滸苔提取物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)作用有著明顯的差異。蒸餾水的提取物需要較高的添加濃度才會(huì)對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，說(shuō)明蒸餾水的提取效果比有機(jī)溶劑差。這和東海原甲藻的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果一致。濃度為0.03 g/L(約需滸苔的新鮮藻體0.11 g濕重/L干燥得到)有機(jī)溶劑提取物添加時(shí)中肋骨條藻的生長(zhǎng)有著輕微差異，其中甲醇提取物對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)影響較小，與對(duì)照組相比有著極小的抑制作用;而此濃度乙酸乙酯與正己烷提取物對(duì)中肋骨條藻則表現(xiàn)為一定的促進(jìn)作用。此濃度時(shí)乙酸乙酯提取物對(duì)藻體的作用與東海原甲藻實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)有一定差異，甲醇與正己烷一致。濃度較高的提取物添加則對(duì)中肋骨條藻均表現(xiàn)為不同程度的抑制作用。蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷滸苔提取物影響中肋骨條藻生長(zhǎng)的致死作用閾值濃度分別為 20.00、1.25、1.25、2.50 g/L(相當(dāng)于滸苔新鮮藻體濃度為 88.00、5.50、5.50、11.00 g 濕重/L)。說(shuō)明甲醇、乙酸乙酯的對(duì)滸苔干粉末的提取液對(duì)中肋骨條藻的克生作用最為明顯，其次是正己烷，最差的是蒸餾水提取液。與東海原甲藻實(shí)驗(yàn)相對(duì)比，各種溶劑提取物對(duì)中肋骨條藻的致死作用閾值濃度較大。此外，由滸苔各個(gè)溶劑提取物對(duì)中肋骨條藻的72 h EC50值的對(duì)比能得出相同的結(jié)論。

2.4 不同溶劑提取物對(duì)兩種赤潮藻克生作用的比較

不同溶劑提取物在不同濃度添加時(shí)對(duì)兩種赤潮藻72 h抑制率的比較如圖4所示。從整體上可以明顯看出相同條件的提取物添加時(shí)，對(duì)東海原甲藻的72 h抑制率遠(yuǎn)大于對(duì)中肋骨條藻的抑制率。并且高濃度(≥0.63 g/L)的有機(jī)溶劑提取物添加時(shí)，東海原甲藻3 d內(nèi)均已死亡，無(wú)法算出72 h抑制率。

滸苔蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的克生作用差異較大。濃度為1.25 g/L的滸苔蒸餾水提取物添加對(duì)東海原甲藻的72 h抑制率為負(fù)值(－11.1%)，表現(xiàn)為較小的促進(jìn)作用。而此濃度的蒸餾水提取物添加對(duì)中肋骨條藻的72 h抑制率為正值(6.0%)，表現(xiàn)為較小的抑制作用。濃度為2.50 g/L和2.50 g/L蒸餾水提取物提取物對(duì)這兩種赤潮藻的72 h抑制率均為正值且差異較大，對(duì)東海原甲藻的72 h抑制率約為中肋骨條藻的5倍。說(shuō)明蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻的克生作用高于對(duì)中肋骨條藻的克生作用，主要表現(xiàn)為抑制作用。此外，由表3中的滸苔蒸餾水提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為1.79 g/L與11.74 g/L可得出一致的結(jié)論。

滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的抑制率如圖4所示。低濃度(0.03 g/L與0.13 g/L)滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h抑制率相近。高濃度(≥0.25 g/L)滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的抑制率的差異較大，隨著添加濃度的增大，對(duì)東海原甲藻的抑制率迅速增大，而對(duì)中肋骨條藻抑制率增大的趨勢(shì)相對(duì)緩和些。此外，由表3中的滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為0.16 g/L與0.22 g/L也可得滸苔甲醇提取物對(duì)東海原甲藻的抑制作用更顯著些。

圖4 不同溶劑提取物對(duì)兩種赤潮藻的72 h抑制率比較Fig.4 The inhibition of different solvent extracts of Enteromorpha on the two red tide microalgae

滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的克生作用在低濃度添加時(shí)表現(xiàn)為相反的現(xiàn)象。0.03 g/L濃度的滸苔乙酸乙酯提取物添加對(duì)東海原甲藻表現(xiàn)為較小的抑制作用，而對(duì)中肋骨條藻則表現(xiàn)為較小的促進(jìn)作用。較高濃度的滸苔乙酸乙酯提取物，均隨著濃度的增加對(duì)兩種藻體的抑制率均隨著增大。同條件下的滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻的72 h抑制率比對(duì)中肋骨條藻的72 h抑制率要高。濃度為0.50 g/L的滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻的72 h抑制率迅速升高，說(shuō)明已臨近藻種的致死作用閾值濃度。大于此濃度的滸苔乙酸乙酯提取物添加使東海原甲藻藻體迅速死亡，計(jì)算不出其72 h抑制率。說(shuō)明滸苔乙酸乙酯提取物添加對(duì)東海原甲藻的克生作用遠(yuǎn)大于對(duì)中肋骨條藻的克生作用，這與滸苔甲醇提取物的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。此外，由表3中的滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為0.14 g/L與0.19 g/L也可得滸苔乙酸乙酯提取物對(duì)東海原甲藻的抑制作用更顯著些。

滸苔正己烷提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的抑制率如圖4所示。低濃度(0.03 g/L)的滸苔正己烷提取物添加對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的克生作用均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，對(duì)東海原甲藻的促進(jìn)作用更為明顯。當(dāng)滸苔正己烷提取物添加濃度的增加，對(duì)東海原甲藻的72 h抑制率迅速增加，濃度大于0.50 g/L時(shí)3 d內(nèi)藻體全部死亡。而隨著滸苔正己烷提取物添加濃度的增加中肋骨條藻的72 h抑制率相對(duì)變化較小。其中，在添加濃度為0.13 g/L至0.63 g/L時(shí)72 h抑制率相對(duì)變化極小。當(dāng)滸苔正己烷提取物添加濃度為1.25 g/L時(shí)中肋骨條藻的72 h抑制率迅速增大，說(shuō)明此時(shí)已臨近其致死作用閾值濃度。從整體上分析，滸苔正己烷提取物添加對(duì)東海原甲藻的克生作用遠(yuǎn)大于對(duì)中肋骨條藻的克生作用，這與滸苔甲醇提取物以及乙酸乙酯提取物的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。此外，由表3中的滸苔正己烷提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值分別為0.81 g/L與0.24 g/L也可得滸苔正己烷提取物對(duì)東海原甲藻的抑制作用更顯著些。

綜上所述，滸苔組織中確實(shí)含有能抑制或者促進(jìn)兩種赤潮藻生長(zhǎng)的克生物質(zhì)，這與國(guó)外內(nèi)的一些關(guān)于大型藻類的研究相一致。Jeong等［22］研究發(fā)現(xiàn)多種大型海藻的組織提取物對(duì)赤潮藻具有殺藻活性，發(fā)現(xiàn)一些綠藻、褐藻和紅藻組織的甲醇及蒸餾水提取物對(duì)一些典型的赤潮藻具有強(qiáng)烈的殺藻作用。大型海藻Myriophyllum spicatum能夠持續(xù)向海洋系統(tǒng)中分泌不穩(wěn)定的化合物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)具有一定的抑制作用［2］?；粼樱?3］等研究也發(fā)現(xiàn)滸苔新鮮組織內(nèi)存在能抑制米氏凱倫藻的克生物質(zhì)。賈睿［24］等人研究發(fā)現(xiàn)滸苔組織對(duì)赤潮異彎藻的生長(zhǎng)具有一定的克生作用，滸苔干粉末與赤潮異彎藻的共生系統(tǒng)，干粉末濃度為1.6 g/L時(shí)對(duì)赤潮異彎藻產(chǎn)生明顯的抑制作用，可以初步推測(cè)共培養(yǎng)系統(tǒng)比滸苔提取物對(duì)赤潮藻的抑制效果更好，賈睿［24］等人還發(fā)現(xiàn)克生物質(zhì)具有較高的極性，這與本研究的結(jié)論一致。此外，滸苔對(duì)赤潮異彎藻的致死作用閾值濃度比中肋骨條藻和東海原甲藻要低些。證明了滸苔對(duì)各種微藻生長(zhǎng)的抑制作用各有差異，但起抑制作用的物質(zhì)普遍均有較高的極性。

從抑制率數(shù)值上來(lái)看東海原甲藻與中肋骨條藻對(duì)各種溶劑提取物的敏感程度不同?？傮w來(lái)看，低濃度時(shí)，東海原甲藻與中肋骨條藻敏感程度相近;濃度稍高，東海原甲藻較中肋骨條藻敏感。這可能是由于東海原甲藻和中肋骨條藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同所致。由表3滸苔提取物對(duì)東海原甲藻與中肋骨條藻的72 h EC50值來(lái)看，不同溶劑的滸苔提取物對(duì)東海原甲藻的抑制作用比中肋骨條藻要顯著些。另外，從圖4中可以很直觀的看出對(duì)這兩種藻克生作用的濃度效應(yīng)，即濃度越大對(duì)其抑制作用越強(qiáng)，某些溶劑的提取物在低濃度情況下可以對(duì)藻體產(chǎn)生促進(jìn)作用。王悠［6，25］等也報(bào)道了一些大型藻類對(duì)微藻的克生作用具有低促高抑的特點(diǎn)，并且有作用種屬的特異性。這也說(shuō)明了滸苔對(duì)赤潮藻的抑制作用的特點(diǎn)都極其相似。

此外，克生物質(zhì)的分離與提取研究相對(duì)較少。別聰聰?shù)龋?6］人發(fā)現(xiàn)包括腸滸苔在內(nèi)的大型藻對(duì)中肋骨條藻的抑制物質(zhì)，主要包括9-十八炔、鄰苯二甲酸二異丁酯、17-烯十八醛等。具體哪種物質(zhì)具有的抑制效果更顯著需進(jìn)一步驗(yàn)證。孫穎穎等［27］人研究分析克生物質(zhì)是通過(guò)影響細(xì)胞蛋白質(zhì)以及多糖的合成來(lái)抑制微藻的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本文探索和討論了4種不同溶劑(包括蒸餾水和甲醇、乙酸乙酯、正己烷3種有機(jī)溶劑)的滸苔干粉末提取物對(duì)東海原甲藻和中肋骨條藻生長(zhǎng)的克生作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滸苔提取物中確實(shí)含有可以影響這兩種赤潮藻類生長(zhǎng)的克生物質(zhì)，克生作用具有較明顯的濃度效應(yīng)，濃度低時(shí)(0.03 g/L)可能會(huì)表現(xiàn)為一定的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，在較高的濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制作用，隨著添加濃度增加，抑制作用變強(qiáng)，即表現(xiàn)出“低促高抑”的特點(diǎn)，這與滸苔對(duì)其他微藻生長(zhǎng)的作用［24-27］相似。

蒸餾水提取物對(duì)兩種赤潮藻的克生作用小于有機(jī)溶劑提取物，在有機(jī)溶劑中，甲醇和乙酸乙酯提取物對(duì)藻體的克生效果最好，正己烷相對(duì)較差。根據(jù)相似相溶原則，可以初步斷定該類克生物質(zhì)中最有效的成分應(yīng)為具有相對(duì)較高極性的有機(jī)物。

兩種赤潮藻對(duì)克生物質(zhì)的敏感程度不同，東海原甲藻對(duì)克生物質(zhì)的敏感性高于中肋骨條藻。

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