NO參與AM真菌與煙草共生過程

王 瑋，趙方貴，侯麗霞，車永梅，劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，青島 266109)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza，AM)是一種古老的營專性活體寄生的土壤微生物，可以與陸地上80%的高等植物共生，并形成菌根［1］。業(yè)已證明AM真菌可以促進植物對礦質(zhì)元素(如氮、磷、鉀等)的吸收［2-3］，改善植物的根際微環(huán)境［4］，提高植物的抗鹽和抗旱等抵御逆境的能力［5］，進而促進植物體的生長。在AM真菌與植物的共生過程中有一系列信號分子的傳遞，其中Ca2+是AM真菌共生體的早期信號物質(zhì)［6］，由AM真菌分泌產(chǎn)生的菌根形成因子(Myc因子)［7］經(jīng)Ca2+信號的傳遞后，可誘導宿主合成和分泌諸多下游信號分子從而保證真菌隨后侵染宿主并在宿主的根內(nèi)延伸;宿主植物根部分泌類黃酮物質(zhì)可以啟動菌根－宿主植物共生體中的一些蛋白質(zhì)的合成及一些其它化合物的分泌，刺激AM真菌孢子的萌發(fā)［8］。AM真菌與植物共生后還可以誘導植物根系中乙烯(ethylene，ETH)、水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和過氧化氫(H2O2)等信號分子產(chǎn)生［9-10］;Fester和 Hause［11］利用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)等 3 種不同染色手段在被根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)侵染的玉米、煙草和苜蓿的根部和菌絲中均檢測到H2O2。研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌對由宿主根部所分泌的strigolactone(5-deoxy-strigol)能夠做出快速強烈的反應［12］，這說明在AM真菌與宿主植物根部之間存在有效的信號級聯(lián)放大系統(tǒng)。目前雖已得知AM真菌可以誘導宿主植物分泌和產(chǎn)生多種信號分子，但是AM真菌與宿主之間的信號分子的種類及其信號轉(zhuǎn)導機制還不甚很清楚。

一氧化氮(NO)是一種普遍存在于植物體內(nèi)的內(nèi)源性氣體信號分子［13］，參與了植物對氣孔運動［14］、逆境應答［15］以及對植物生長發(fā)育的調(diào)控［16］等多種生理過程。植物中NO的主要來源于硝酸還原酶(NR)途徑，植物中NR利用NAD(P)H作為電子供體，催化硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}，促進NO的生成［17］。有報道，NO專一性清除劑可以抑制萘乙酸對側(cè)根生長的作用，說明NO可能作為信號分子參與生長素誘導的側(cè)根生長過程［18］。AM真菌與宿主植物共生后能夠促進宿主根系的延伸，吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)，NO是否也作為信號分子參與共生過程，目前尚未見報道。

本實驗以煙草為材料，苗期接種G.m，通過檢測接種后煙草側(cè)根中NO的含量、NR的活性以及nia-1基因的表達量，側(cè)根和菌絲中NO的水平，以探究NO在AM真菌與煙草共生過程中的作用，為深入了解AM真菌與植物體共生的信號機制提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試煙草(Nicotiana tabacum，品種為CF90NF)由中國煙草公司青島分公司提供。供試AM真菌為摩西球囊霉(Glomus mosseae，G.m)由青島農(nóng)業(yè)大學菌根技術(shù)實驗室提供。AM真菌接種物為經(jīng)三葉草擴繁后，含培養(yǎng)基質(zhì)、孢子、菌絲和侵染根段的混合物。

NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)、NO專一性熒光探針 DAF-2DA(4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2 DA)、NO 清除劑 2-4，4，5，5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(2-(4-carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxidepotassium salt，cPTIO)、NR 抑制劑鎢酸鈉(sodium tungstate，Na2WO4)均購于Sigma公司(U.S.A);其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 材料處理

將煙草種子經(jīng)10%NaClO滅菌15 min，無菌水沖洗5次后，點種于含草炭土∶土∶河沙=2∶2∶1的滅菌基質(zhì)中，于25℃，16 h/8 h光周期，光強120—400μmol m－2s－1下培養(yǎng)。生長4周后取生長狀態(tài)一致的煙草苗，移栽至含滅菌河沙的小盆中(直徑×高=11.5 cm×8 cm)，同時接種AM真菌G.m(接種量為菌種∶基質(zhì)=1∶10)(對照為接種等量滅菌基質(zhì))。每兩天噴施1/2Hoagland營養(yǎng)液。

在接種后的0、5、10、15、20和30d分別取煙草側(cè)根，用蒸餾水將根部基質(zhì)沖洗干凈，用于測定內(nèi)源的NO含量、NR活性、Nia-1基因表達量及側(cè)根中NO的熒光強度。在接種后的20、25、30d用Tennant的方法［19］獲得菌絲，用于NO的熒光檢測。

在接種后5d開始向煙草根部基質(zhì)中加入以下處理液:NO清除劑c-PTIO(2.0 mmol/L)、NO供體硝普鈉SNP(1.0 mmol/L)、NR抑制劑鎢酸鈉(1 mmol/L)，對照加入等量的1/2Hoagland營養(yǎng)液，分別在處理后10、15、20、25和30d取煙草側(cè)根用于檢測煙草側(cè)根的侵染率，并在20d時分別取側(cè)根和菌絲測定NO熒光強度。

1.3 方法

1.3.1 NO 含量和NR 活性的檢測

用NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定NO含量。取0.1 g煙草側(cè)根加0.9%NaCl 0.9 mL，勻漿;12000×g離心10 min，取上清，沸水浴5 min;12000×g離心5 min，取上清，稀釋10倍用于檢測。在550 nm波長下，測定吸光度值，按照試劑盒說明，計算出組織中的NO水平。

用NR試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定NR活性。取煙草側(cè)根，洗凈，用濾紙吸干后，放入誘導劑應用液中浸泡誘導2 h，取出用濾紙吸干，置于－20℃冷凍30 min后濾紙吸干并稱取0.2 g，按重量體積比加入1.8 mL勻漿介質(zhì)，冰浴研磨制成10%的勻漿液，4000 r/min離心10 min，取上清在550 nm波長下，測定吸光度值，按照試劑盒說明，計算出組織中的NR活力。

1.3.2 NO 的熒光檢測

取不同處理的煙草側(cè)根和菌絲，加入DAF-2DA(20μmol/L)，25℃下避光孵育20 min，孵育完畢后用緩沖液沖洗，除去吸附的染料。將處理好的表皮條置于載玻片上，蓋好蓋片，用488 nm藍光激發(fā)，經(jīng)尼康(NikonTE2000)倒置熒光顯微鏡掃描獲得根細胞和菌絲中NO的靜態(tài)分布圖。

1.3.3 Nia-1的熒光實時定量PCR檢測

利用TriZol試劑盒提取煙草根系的總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1條鏈，作為模板，同時設(shè)立負對照。Real-time PCR的程序為:95℃ 5 min，95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 15 s，40個循環(huán);Melt曲線從72℃至99℃，第1步維持45 s，以后每升高1℃ 維持5 s。Nia-1的正向和反向引物序列分別為5'-AATCAGGTGGATGGATGGCGAAG-3'和5'-TTCGCCATCCATCCACCT-3'。β-actin的正向和反向引物序列分別為5'-GATGAGTTGGGTGTTGCTCCT-3'和5'-GAAGTCCTCGTTGTTGCGTTG-3'。用熔解曲線法檢測實時定量PCR產(chǎn)物的特異性，采用MyiQ software進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有結(jié)果都是3次重復的平均值±標準誤差。測定結(jié)果用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌對煙草側(cè)根和AM真菌NO的影響

2.1.1 AM真菌與煙草的共生過程煙草側(cè)根NO含量的變化

利用分光光度法和NO的特異性熒光探針DAF-2DA分別檢測了AM真菌與煙草共生過程中NO的變化。由圖1可知，煙草側(cè)根中含有一定水平的內(nèi)源NO，接種AM真菌后煙草側(cè)根中NO含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在苗期接種后10d達到最大值(P＜0.05)，同時煙草側(cè)根中NO的熒光強度亦顯著增強(圖2A)。

cPTIO為NO清除劑，SNP為NO的供體，Na2WO4為的NO合成酶NR的抑制劑。為了進一步研究NO在AM真菌與煙草共生過程中的作用，在NO猝發(fā)時分別觀測了NO清除劑、供體和合成酶抑制劑的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cPTIO和Na2WO4可以顯著降低NO的含量，而SNP使煙草側(cè)根中NO含量增加了71.2%(圖1)。由此推測，在AM真菌與煙草共生過程中的NO可能是由煙草側(cè)根產(chǎn)生的，且NR是NO的主要來源。

2.1.2 AM真菌與煙草的共生過程AM菌絲NO水平的變化

圖1 NO清除劑和抑制劑對AM真菌與煙草共生過程中煙草側(cè)根NO含量的影響Fig.1 The change in NO concentration in the lateral roots of tobacco symbiosis with Glomus mosseae after treatment with NO scavenger and inhibitor

為了進一步探明AM真菌與煙草的共生過程NO的來源，以DAF-2DA作為NO的特異性熒光探針，檢測了菌絲中NO水平的變化。由圖2B可以看出，在接種后20—30d時在菌絲中檢測到綠色熒光，且隨著接種時間的延長，菌絲中熒光強度稍微增強。菌絲中NO變化的時間要遲于煙草側(cè)根NO的猝發(fā)(圖2A)，且NO的清除劑和抑制劑沒有明顯改變菌絲中的NO熒光強度，由此推測，AM真菌與煙草共生過程中NO主要由煙草側(cè)根產(chǎn)生，菌絲中可能存在其他來源的NO。

圖2 AM真菌與煙草共生過程中煙草側(cè)根和G.m菌絲中NO的熒光變化(標尺=100μm)Fig.2 Localization of fluorescence due to nitric oxide in tobacco lateral roots and the hyphae of G.m after treatment with the NO-specific fluorophore DAF-2DA(Scale-bars=100μm)

2.2 AM真菌對煙草根系NR活性和基因表達的影響

圖3結(jié)果顯示，接種G.m后煙草側(cè)根中NR活性和Nia-1的表達量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均于接種后10天活性達到最大值，該變化趨勢與NO含量(圖1)的變化趨勢基本一致。由此推斷，NR途徑參與AM真菌誘導的煙草側(cè)根中NO的合成。綜合圖1、圖2和圖3的結(jié)果，從生理和分子水平證明了來自NR途徑的NO參與AM真菌與煙草的共生過程。

圖3 AM真菌與煙草共生過程中煙草側(cè)根NR活性和Nia-1基因表達的變化Fig.3 The change in NR activity and Nia-1 gene relative expression level in the lateral roots of tobacco symbiosis with Glomus mosseae

2.3 NO清除劑和NR抑制劑對煙草AM真菌侵染率的影響

為了進一步證明來自NR的NO參與AM真菌與煙草共生過程，觀測了NO清除劑和合成抑制劑對煙草AM真菌侵染率的影響。結(jié)果表明，NO的清除劑和抑制劑可以顯著降低AM真菌侵染率，在接種后30d時侵染率分別下降了38.4%和26.4%，而NO供體SNP卻使AM侵染率增加了9.1%(圖4)。同時，外施一定濃度的SNP能有效增加側(cè)根中的孢子數(shù)和菌絲的分布，NO的清除劑c-PTIO和NR抑制劑Na2WO4處理后煙草側(cè)根中孢子數(shù)和菌絲量有所減少(結(jié)果未顯示)。說明NO是AM真菌與煙草的共生過程的重要組分。

3 討論

植物與微生物共生是自然界中普遍存在的一種生物學現(xiàn)象，其中高等植物和叢枝菌根真菌共生形成的菌根與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。AM真菌與植物之間的互利共生依賴于兩者之間的信號傳遞，AM真菌通過特異的信號識別宿主，然后侵染宿主并與之共生。業(yè)已證明，宿主根系分泌的類黃酮、獨腳金萌發(fā)素內(nèi)酯以及菌根因子、Ca2+、SA和JA等信號分子均參與了該共生過程［8-10］，但AM真菌與植物共生的信號轉(zhuǎn)導機制的研究才剛起步。NO是一種普遍存在于植物體內(nèi)的、具有生物活性和信號轉(zhuǎn)導作用的內(nèi)源性氣體信號分子，它參與調(diào)節(jié)植物的許多生命活動，而且作為防御反應中的關(guān)鍵信使，參與了植物對外界環(huán)境脅迫的應答［20］，但NO在植物與微生物互作過程中的作用鮮見報道。本實驗綜合利用分光光度法、熒光檢測技術(shù)以及分子生物學等實驗技術(shù)，結(jié)合藥理學實驗檢測了AM真菌侵染煙草過程中NO水平的變化，發(fā)現(xiàn)接種G.m后煙草側(cè)根中NO含量(圖1)和NO熒光強度(圖2A)均明顯增加，NO的清除劑能顯著降低側(cè)根中NO的水平(圖1)和熒光強度(圖2C)，但對菌絲中的熒光強度影響不顯著(圖2C);并且清除NO可以降低根系的侵染率(圖4)，表明NO在G.m與煙草共生的過程中發(fā)揮了重要作用，NO可能作為AM真菌與宿主互利共生的重要信號物質(zhì)。

植物體中的NO的合成主要酶途徑是NR，許多實驗顯示該途徑產(chǎn)生的NO參與調(diào)控植物的生長發(fā)育［16］;調(diào)節(jié)ABA誘導的擬南芥(Arabidopsis thaliana)氣孔關(guān)閉［17，21］;參與了馬鈴薯(Solanum tuberosum)對晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染的應答反應［22］、水分脅迫下玉米(Zea mays)葉片中NO的產(chǎn)生［15］以及其他非生物脅迫過程［23］。高等植物的 NR 由 nia 編碼，至今已經(jīng)在擬南芥［24］、菠菜(Spinacia oleracea)［25］、煙草［26］、番茄(Solanum lycopersicum)［27］等植物中克隆了nia或nia的cDNA。菜豆中存在兩個nia基因位點，niaR-1在根中表達，niaR-2在葉片中表達［28］。煙草中編碼NR的基因主要有Nia-1和Nia-2［29］。本實驗發(fā)現(xiàn)(圖3)，接種G.m也可以誘導煙草根系NR基因Nia-1的表達;同時苗期接種G.m后，煙草側(cè)根中的NR活性明顯升高。且NR的抑制劑鎢酸鈉可以大大降低AM真菌與煙草共生過程中NO的產(chǎn)生(圖1)、顯著減弱煙草側(cè)根中的NO熒光強度(圖2C)，但是對菌絲中的NO熒光變化沒有明顯影響;NR抑制劑也影響了AM真菌對煙草的侵染。由此推測，來自NR途徑的NO參與了AM真菌與煙草共生過程，且NO主要由煙草側(cè)根產(chǎn)生。

圖4 NO清除劑和NR抑制劑對AM真菌侵染率的影響Fig.4 The change in the colonization rate of tobacco by G.m after treatment with NO scavenger and inhibitor

本文首次為信號分子NO參與AM真菌與煙草的共生過程提供了生理學、細胞學和分子生物學的實驗證據(jù)。今后尚可以篩選或構(gòu)建煙草NO過表達和缺失突變體為深入了解NO在AM真菌與植物共生過程中的作用提供遺傳學的依據(jù)。植物與微生物共生的過程非常復雜，在日本百脈根中發(fā)現(xiàn)有9個基因(LjSYMRK、LjCASTOR、LjPOLLUX、LjSYM3、LjSYM6、LjSYM15、LjSYM24、LjNUP133 和 LjNUP85)與真菌侵染有關(guān)［30］，而且已經(jīng)明確了這些基因編碼的蛋白質(zhì)的類型。這些基因是否與AM真菌與植物的互作有關(guān)?Ca2+是AM真菌識別宿主的早期信號物質(zhì)［6］，Myc因子［7］經(jīng)Ca2+信號的傳遞，可誘導宿主合成和分泌諸多信號分子;AM真菌與植物共生過程中是否還存在其他信號物質(zhì)，這些信號物質(zhì)與NO、Ca2+，H2O2的關(guān)系怎樣，它們之間是如何相互作用的，還有待進一步研究。只有了解共生雙方的識別信號及共生體結(jié)構(gòu)的形成信號，才能解開AM真菌與宿主植物共生的謎團。

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