分子診斷實(shí)驗(yàn)室核酸污染清除方法研究

王 哲，秦怡璠，王一萍，曾杰生

（1.廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院），廣東 佛山 528311；2.佛山丁智生物科技有限公司，廣東 佛山 528311）

2019 年12 月份新冠疫情發(fā)生后，疫情在全球的大流行對(duì)各國(guó)公共衛(wèi)生和全球經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重威脅，了解和遏制新冠病毒的環(huán)境傳播模式對(duì)各國(guó)制定相關(guān)公共衛(wèi)生政策至關(guān)重要［1］。早發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行流動(dòng)性管控是快速控制新冠病毒傳播的方法，新冠病毒核酸熒光定量 PCR 檢測(cè)由于其高靈敏度和準(zhǔn)確性成為公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。

DNA 在生活和工作環(huán)境中普遍存在，人們說(shuō)話、打噴嚏、咳嗽，即使戴著口罩也會(huì)引入 DNA，普通的污染途徑包括通過(guò)離體唾液、灰塵及氣溶膠等介質(zhì)的傳播方式，或是樣本受到污染［3］。在分子實(shí)驗(yàn)室，造成假陽(yáng)性的原因有多種，比如實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范［4］，實(shí)驗(yàn)室管理不當(dāng)［5］，但更多的核酸污染是重復(fù)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中累積，一個(gè) PCR 反應(yīng)產(chǎn)物能產(chǎn)生多達(dá)109個(gè)拷貝的靶序列的 PCR 實(shí)驗(yàn)，如果產(chǎn)物被霧化，即便是最小的氣溶膠體也會(huì)包含106個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物以上，在短時(shí)間內(nèi)，氣溶膠產(chǎn)物擴(kuò)散累積將污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的試劑、耗材設(shè)備和通風(fēng)系統(tǒng)［6］。一般利用紫外光照射和高壓滅菌來(lái)處理實(shí)驗(yàn)耗材中的 DNA 污染，有實(shí)驗(yàn)證明，高壓滅菌（128 ℃，420 min）后，再次干燥，暴露于10～60 J/cm2的紫外光照射下能夠清除，但此方法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)并且紫外線透射度有限、高壓滅菌對(duì)耗材有選擇性等局限［7-8］。無(wú)菌醫(yī)療產(chǎn)品常用環(huán)氧乙烷（EO）氣體來(lái)滅菌，通過(guò) EO 處理 3 h可使 PCR 擴(kuò)增的 DNA 減少 104個(gè)數(shù)量級(jí)，因此利用 EO 來(lái)阻止 DNA 擴(kuò)增的方法是有效的，但是 EO并不能完全清除 DNA 污染，且作用后會(huì)有副產(chǎn)物遺留，導(dǎo)致這種方法難以在分子實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用［9-10］。因此，需要尋求一種更便捷的辦法來(lái)預(yù)防或減少核酸污染。核酸清除劑是目前市面上商品化使用的專門清除核酸污染的試劑，針對(duì)性強(qiáng)、效果好且毒性小。核酸清除劑是通過(guò)產(chǎn)生活性氧自由基，達(dá)到對(duì)核酸片段氧化降解目的。本文采用了含有雙氧水、抗壞血酸、酸堿緩沖液及起到催化作用的金屬陽(yáng)離子的核酸清除劑，分別測(cè)試了DNA 清除劑對(duì)長(zhǎng)片段和PCR 產(chǎn)物的短片段的降解效果、對(duì)氣溶膠的處理效果、對(duì)桌面儀器表面的處理效果來(lái)分析核酸的降解能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

1）主要試劑見表1。

表1 主要試劑及試劑品牌

2）主要設(shè)備見表2。

表2 主要儀器名稱及品牌

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1）配制DNA 清除劑。

配制1 L pH 為3 的0.2 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。檸檬酸稱取35.74 g，檸檬酸鈉稱取4.12g；取檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液900 mL，稱取 L-抗壞血酸17.612 g 使其濃度達(dá)到0.1 mol/L，攪拌溶解；稱取 CuSO4·5H2O 使其濃度達(dá)到0.02 mol/L；加30 % H2O26 mL，使其達(dá)到 0.000 1 mol/L；加EDTA 3.36 g，使其濃度達(dá)到0.01 mol/L；將整體溶液補(bǔ)足至1 L；置于 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2）DNA 提取。

將鼠傷寒沙門氏菌接種于 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng) 8 h，沙門氏菌各取 500 μL 菌液（108CFU/mL），根據(jù) DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，保存于 -20 ℃ 備用。

3）凝膠電泳。

使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，配制 1.5 % 瓊脂糖凝膠，使用 1 mm 齒梳。分別取沙門氏菌高分子量DNA 和擴(kuò)增過(guò)后的低分子量 DNA 各 5 μL，與等體積的DNA 清除劑反應(yīng) 20 min 后作為待測(cè)樣品，高分子量 DNA 和低分子量 DNA 使用不同的 Marker，分開進(jìn)行電泳。Marker 加樣量為 6 μL，樣品加樣量為9 μL。電壓 130 V，20 min。

4）樣本采集。

選擇 PCR 實(shí)驗(yàn)室污染嚴(yán)重的區(qū)域并對(duì)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)區(qū)域及儀器耗材進(jìn)行采樣。我們選擇冰箱、離心機(jī)、桌面、門把手、超凈工作臺(tái)及移液槍 6 個(gè)區(qū)域，使用 PCR 級(jí)水浸濕棉簽拭子，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行旋轉(zhuǎn)涂抹擦拭，6 個(gè)區(qū)域分別選擇 1 個(gè)位點(diǎn)作為采樣區(qū)域，將擦拭處理過(guò)的棉簽溶于裝有 500 μL PCR 級(jí)水的離心管中。對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境使用DNA 清除劑進(jìn)行徹底清潔，處理后以上述同樣的方式進(jìn)行取樣。

5）DNA 清除劑對(duì) PCR 的抑制效果測(cè)定。

向 PCR 反應(yīng)體系中加入DNA 清除劑或取其稀釋液 5 μL；將體系補(bǔ)足至 20 μL。DNA 清除劑稀釋，按照 10 的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，稀釋 5 個(gè)級(jí)別。

6）DNA 清除劑降解效率測(cè)試。

取 5 個(gè) EP 管，向管中加 10 μL DNA 樣本，并編號(hào) 1～5，向 1、2 管中加雙蒸水 20 μL，向 3～5 管中加 DNA 清除劑 20 μL，靜置 20 min 后將 5 個(gè)孔中的試劑全部吸出，用 20 μL 雙蒸水進(jìn)行清洗，清洗兩遍，取第二次的水為樣本，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

7）PCR 反應(yīng)。

準(zhǔn)備沙門氏菌上游引物 invA-F（5’TGCGAGTGG TAAATTATTCCGAT3’）和 下 游 引 物 invA-R（5’GCCA GACAGTGGTAAAGCTC3’）進(jìn)行PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增，以提取的沙門氏菌 DNA 為模板，反應(yīng)體系為 20 μL，分別是：PCR Buffer 10 μL，10 μmol/L PCR 上下游引物各1 μL，模板 DNA 1 μL，補(bǔ)充水至 20 μL。擴(kuò)增程序PCR 反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后的產(chǎn)物 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本實(shí)驗(yàn)中 qPCR 的反應(yīng)體系為 20 μL，分別是：PCR Buffer 10 μL，10 μmol/L PCR 引物各 1 μL，模板 DNA 5.5 μL，補(bǔ)充水至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1）DNA 清除劑對(duì)長(zhǎng)片段和短片段的降解。

經(jīng)過(guò) PCR 后，產(chǎn)物長(zhǎng)度大約 200 bp，提取的核酸片段長(zhǎng)度超過(guò) 10 000 bp。如圖1 所示，（a）為DNA 清除劑作用于短核酸片段的實(shí)驗(yàn)，（b）為作用于長(zhǎng)片段核酸的實(shí)驗(yàn)，其中泳道 1 為對(duì)照組，泳道 2為實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)過(guò)核酸清除處理后，對(duì)照組均有明顯的條帶，實(shí)驗(yàn)組完全看不出電泳條帶，說(shuō)明本文中的 DNA 清除劑具有較強(qiáng)的核酸降解能力。經(jīng)分析，該試劑在反應(yīng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生較多的羥基自由基，產(chǎn)生的羥基自由基能夠與核酸片段快速結(jié)合，從而發(fā)生降解反應(yīng)，從而達(dá)到降解效果。

圖1 DNA 清除劑降解核酸后電泳圖

2）DNA 清除劑對(duì) PCR 的抑制作用。

將 DNA 清除劑稀釋10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍、100 000 倍及以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別將稀釋的清除劑與 DNA 模板進(jìn)行等體積混合，取5 μL 作為模板進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增。

圖2 為 DNA 清除劑對(duì) PCR 擴(kuò)增的抑制反應(yīng)。其中曲線a 指未稀釋的 DNA 清除劑檢測(cè)結(jié)果，曲線b 指稀釋 10 倍的 DNA 清除劑檢測(cè)結(jié)果，曲線c 指稀釋 100 倍及更大倍數(shù) DNA 清除反應(yīng)，曲線d 為未加DNA 清除劑。添加 DNA 清除劑的測(cè)試結(jié)果顯示，高濃度的 DNA 清除劑對(duì) PCR 反應(yīng)具有明顯的抑制作用，如圖2 中曲線 a 和 b，當(dāng)稀釋到 100 倍以后，適當(dāng)?shù)臐舛瓤赡苡兄?PCR 擴(kuò)增，抑制作用不明顯，如圖2 中 c 組擴(kuò)增曲線。與曲線d 對(duì)比，適當(dāng)濃度的DNA 清除劑可能有助于PCR 擴(kuò)增。

圖2 DNA 清除劑對(duì) PCR 擴(kuò)增的抑制

3）DNA 清除劑清除效率。

在測(cè)試DNA 清除劑對(duì)核酸的降解效率中，處理組與對(duì)照組的Ct值出現(xiàn)明顯的差異如圖3。其中曲線A 為帶有閾值線的擴(kuò)增曲線，曲線B 為去掉閾值線的擴(kuò)增曲線，a 為陰性對(duì)照，b 為陽(yáng)性對(duì)照，c 為對(duì)照組第1 次處理取樣，d 為對(duì)照組第 2 次清洗取樣，e 為DNA 清除劑組第 2 次清洗取樣，f 為DNA清除劑組第 1 次處理取樣。實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照可能是樣本濃度過(guò)高造成擴(kuò)增曲線異常，對(duì)比不設(shè)置閾值熒光曲線，確定陽(yáng)性擴(kuò)增曲線是可信的，如圖3 所示。在雙蒸水處理做為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中顯示，第一處理的Ct（＜1）和第二次清洗取樣的Ct（＞10），根據(jù)PCR 擴(kuò)增模型，Ct值相差 3.32 濃度相差10 倍，說(shuō)明第一次處理到第二次取樣的稀釋倍數(shù)大于1 000倍，即推測(cè) DNA 清除劑處理組的稀釋倍數(shù)也大于1 000 倍，根據(jù) DNA 清除劑對(duì) PCR 抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，第二次清洗取樣時(shí)，可以忽略殘存 DNA 清除劑對(duì) PCR 的擴(kuò)增。

圖3 DNA 清除劑對(duì)核酸的降解效率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組的Ct分別是 9.65、9.69、10.08、10.15，平均值為 9.89；實(shí)驗(yàn)組的Ct值為 23.68、23.49、27.72、27.61、25.17、25.42，平均值 25.51。根據(jù)DNA 清除率η=（1-（1/2^（CtDNA清除劑-Ct水）））*100%計(jì)算本研究中的 DNA 清除劑的清除率為99.99%，清除效果明顯。

4）DNA 清除劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室處理效果測(cè)試。

對(duì)實(shí)驗(yàn)室的桌面、移液槍等取樣，進(jìn)行熒光定量 PCR 測(cè)試，得到結(jié)果圖4，圖4 為DNA 清除劑處理前后擴(kuò)增曲線，A 為桌面，B 為移液槍，C 為離心機(jī)，D 為冰箱門，E 為門把手，F(xiàn) 為超凈工作臺(tái)。結(jié)果顯示，核酸清除劑處理桌面、移液槍、離心機(jī)和門把手后，檢測(cè)的Ct值均出現(xiàn)明顯的增大，靶標(biāo)濃度降低，說(shuō)明核酸清除劑具有降解核酸的作用，對(duì)冰箱門和超凈臺(tái)處理前后的Ct變化較小，超凈臺(tái)內(nèi)部屬于相對(duì)干凈的區(qū)域可能是前后Ct變化不大的原因，冰箱可能和接觸的次數(shù)的多少和試劑處理相關(guān)，如圖4 所示。

圖4 DNA 清除劑處理前后擴(kuò)增曲線

3 結(jié)論

隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的成熟，各個(gè)高校、研究所、生物檢測(cè)公司及醫(yī)院等大部分都設(shè)有 PCR 實(shí)驗(yàn)室，PCR實(shí)驗(yàn)室非常容易發(fā)生污染，為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室一般都會(huì)規(guī)定相應(yīng)的條款措施來(lái)預(yù)防，比如在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)污染可能性合理劃分實(shí)驗(yàn)區(qū)域、選擇無(wú)菌實(shí)驗(yàn)耗材、選擇質(zhì)量較好的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、超凈工作臺(tái)或?qū)嶒?yàn)室經(jīng)常進(jìn)行紫外線照射、實(shí)驗(yàn)后的耗材垃圾按時(shí)清潔、部分耗材試劑進(jìn)行高壓滅菌［11］。本文提供了一種高效的DNA 清除劑，處理過(guò)的長(zhǎng)片段和短片段核酸，均有效被降解，用其處理實(shí)驗(yàn)室的表面，檢測(cè)后的Ct均降低，說(shuō)明本研究中提供的 DNA 清除劑可以作為分子擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室清潔劑使用。