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    酶聯(lián)免疫法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中甲羥孕酮的殘留

    2013-12-20 06:55:26張立新馮才偉賈芳芳劉玉梅
    四川畜牧獸醫(yī) 2013年11期
    關(guān)鍵詞:魚肉雞肉孕酮

    張立新,馮才偉,賈芳芳 ,劉玉梅,楊 爍

    (1.北京市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷服務(wù)站,北京 100101;2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206)

    甲羥孕酮又稱甲孕酮,是一種長期避孕藥,也可用于一些對(duì)激素敏感腫瘤的姑息治療;魚類會(huì)因?yàn)樗形⒘康募琢u孕酮而改變性別。人食用含有甲羥孕酮的動(dòng)物源性食品后,會(huì)擾亂人體內(nèi)分泌、生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面的正常功能,還可能致癌、致畸,因此建立檢測(cè)動(dòng)物源性食品中甲羥孕酮?dú)埩舻姆椒ê苡斜匾?。目前,檢測(cè)該類藥物的方法主要是儀器法,但其資金、人員等成本投入較高,不宜推廣。本試驗(yàn)運(yùn)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法,測(cè)定了雞肉和魚肉中甲羥孕酮的殘留量,旨在尋找成本更低的替代檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器 甲羥孕酮ELISA檢測(cè)試劑盒(包含96孔酶標(biāo)板,甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物,底物液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液),購自北京某生物技術(shù)有限公司;氫氧化鈉、乙腈等購自北京某試劑公司;雞肉、魚肉樣品購自超市;酶標(biāo)儀購自上海某分析儀器有限公司,渦旋儀、均質(zhì)器購自湖南某科學(xué)儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品前處理。用均質(zhì)器均質(zhì)肉組織樣本;稱?。?.0±0.05)g均質(zhì)物至50 mL聚苯乙烯離心管中,加入6mL乙腈-0.1mol/L氫氧化鈉溶液,渦動(dòng)2min,4 500 r/min以上,室溫離心5min;取出1mL上清液至15mL干凈的玻璃試管中,于50~60℃氮?dú)饬飨麓蹈?;加?mL復(fù)溶液,用渦旋儀渦動(dòng)1 min,然后取100 μL加入到 900 μL復(fù)溶液中,混勻;最后取50 μL 用于檢測(cè)。

    1.2.2 檢測(cè)步驟。取出所需數(shù)量的微孔板,將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做兩孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置;加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對(duì)應(yīng)的微孔中,然后加入酶結(jié)合物(50 μL/孔),輕輕振蕩、混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min;小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,加入洗滌液(250μL/孔),充分洗滌4~5次,每次間隔10s,倒出板孔內(nèi)的洗滌液,用吸水紙拍干;加入底物液A液(50μL/孔),再加入底物液 B 液(50 μL/孔),輕輕振蕩、混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min;加入終止液(50μL/孔),輕輕振蕩、混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔的吸光度值(OD值)。

    1.2.3 百分吸光率的計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值的平均值,再乘以100%,即

    式中:B——標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值;

    B0——0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

    以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲羥孕酮的實(shí)際濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)1.2.2步驟,分別測(cè)定濃度為0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/L 甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。詳見表1、圖1和圖2。

    表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的ELISA測(cè)定

    圖1 甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

    試驗(yàn)表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度范圍在0.03~0.48μg/L,IC50(50%抑制濃度)為83.0μg/L;線性方程y=-2.1773x+1.5218,R2=0.9938。

    2.2 檢測(cè)限 對(duì)20份空白雞肉和20份空白魚肉樣本進(jìn)行檢測(cè),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光率的濃度。以20份樣本甲羥孕酮濃度的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示檢測(cè)限(MDL),即 MDL=x+3s。結(jié)果顯示,該酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉和魚肉樣本的檢測(cè)限均為1μg/kg。

    2.3 準(zhǔn)確度和精密度 酶聯(lián)免疫法的準(zhǔn)確度用回收率表示,精密度用變異系數(shù)表示。在空白雞肉和魚肉樣本中添加濃度為1、2、4μg/kg的甲羥孕酮,用3個(gè)批次的ELISA試劑盒進(jìn)行回收試驗(yàn),每個(gè)添加量做4個(gè)平行,結(jié)果見表2、表3。

    表2 雞肉樣本精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)

    表3 魚肉樣本精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)

    從表2、表3可見,對(duì)雞肉樣品進(jìn)行添加,甲羥孕酮的平均回收率在68.3%~94.6%之間;對(duì)魚肉樣品進(jìn)行添加,其平均回收率在65.5%~93.2%之間;兩個(gè)樣本的批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%。

    2.4 交叉反應(yīng)率試驗(yàn) 根據(jù)交叉反應(yīng)率公式,計(jì)算得到甲羥孕酮試劑盒與甲地孕酮、孕酮、己烯雌酚、炔諾酮的交叉反應(yīng)率均小于1%,說明該酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性較高。結(jié)果見表4。

    表4 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)

    2.5 儀器法比對(duì)試驗(yàn) 取50份雞肉和魚肉樣本,用“SN/T 1625-2005進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中甲羥孕酮和醋酸甲羥孕酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法:氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法”進(jìn)行儀器對(duì)比試驗(yàn),結(jié)果顯示該儀器法的檢測(cè)限為1μg/kg。表明本次試驗(yàn)所用試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和儀器法的檢測(cè)結(jié)果是一致的。詳見表5、表6。

    表5 雞肉樣本的酶聯(lián)免疫法和儀器法對(duì)比試驗(yàn) μg/kg

    表6 魚肉樣本的酶聯(lián)免疫法和儀器法對(duì)比試驗(yàn) μg/kg

    3 結(jié)論

    酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉和魚肉樣本的檢測(cè)限均為1 μg/kg。當(dāng)甲羥孕酮的添加濃度為 1、2、4μg/kg時(shí),其平均回收率范圍在65.5%~94.6%;交叉反應(yīng)率試驗(yàn)表明該試劑盒的特異性良好;酶聯(lián)免疫法與儀器法的驗(yàn)證結(jié)果一致。由于某些不可避免的人為誤差,不同批次的ELISA試劑盒在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致,而本試驗(yàn)所用甲羥孕酮檢測(cè)試劑盒的批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,重現(xiàn)性較好。該酶聯(lián)免疫法的操作時(shí)間短,靈敏度較高,檢測(cè)限低,不需要昂貴的儀器設(shè)備,操作方法較簡單,因此適合現(xiàn)場(chǎng)大批量檢測(cè)樣本的快速檢測(cè)。

    [1]黃強(qiáng)力,王晶鈺,韓雪清,等.SPR生物傳感器快速檢測(cè)醋酸甲羥孕酮的初步應(yīng)用研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(3):102-105.

    [2]杜 雪.醋酸甲羥孕酮的應(yīng)用及中斷用藥的原因[J].國外醫(yī)學(xué)計(jì)劃生育分冊(cè),1998,17(4):232-233.

    [3]金 鑫.甲羥孕酮致過敏反應(yīng)一例[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2002,2(增刊):306.

    [4]王選年,楊艷艷,邢廣旭,等.鹽酸克倫特羅單抗快速檢測(cè)試劑盒的研制[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(1):75-78.

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